Denne protokollen detaljer en monolag, serum-fri metode for å effektivt generere hepatocytter celler fra humant Pluripotent stamceller (hPSCs) i 18 dager. Dette medfører seks trinn som hPSCs sekvensielt differensiere til mellomliggende celle-typer som primitive strek, definitive endoderm, bakre foregut og lever knopp forfedre før forming hepatocytter celler.
Leveren detoxifies skadelige stoffer, utskiller vitale proteiner, og utfører viktige metabolske aktiviteter, og dermed opprettholde livet. Følgelig leversvikt-som kan være forårsaket av kronisk alkoholinntak, hepatitt, akutt forgiftning, eller andre fornærmelser-er en alvorlig tilstand som kan kulminere i blødning, gulsott, koma, og til slutt død. Men tilnærminger til behandling leversvikt, samt studier av leverfunksjon og sykdom, har vært stymied delvis av mangelen på en rikelig tilførsel av menneskelig leverceller. For dette formål, denne protokollen detaljer effektiv differensiering av menneskelige Pluripotent stamceller (hPSCs) i hepatocytter celler, guidet av en utviklingsmessige veikart som beskriver hvordan leveren skjebne er angitt over seks påfølgende differensiering trinn. Ved å manipulere utviklingsmessige signalering veier for å fremme leveren differensiering og eksplisitt undertrykke dannelsen av uønsket celle skjebne, denne metoden genererer effektivt bestander av menneskelig lever knopp forfedre og hepatocytter-lignende celler ved dager 6 og 18 av PSC differensiering, henholdsvis. Dette oppnås gjennom den timelig-presise kontrollen av de utviklingsmessige signal banene, som utøves av små molekyler og vekstfaktorer i et serum fritt kultur medium. Differensiering i dette systemet oppstår i monolagere og gir hepatocytter-lignende celler som uttrykker karakteristiske hepatocytter enzymer og har evnen til å engraft en mus modell av kronisk leversvikt. Evnen til å effektivt generere et stort antall menneskelige leverceller in vitro har forgreninger for behandling av leversvikt, for narkotika screening, og for mekanistisk studier av leversykdom.
Formålet med denne protokollen er å effektivt differensiere menneskelige Pluripotent stamceller (hPSCs) i beriket bestander av lever knopp forfedre og hepatocytter celler2. Tilgang til en klar tilførsel av menneskelig leveren forfedre og hepatocytter-lignende celler vil akselerere arbeidet med å undersøke leveren funksjon og sykdom og kan aktivere nye cellulære transplantasjon terapi for leversvikt3,4, fempå. Dette har vist seg utfordrende i det siste siden hPSCs (som inkluderer embryonale og indusert Pluripotent stamceller) kan differensiere til alle celle-typer av menneskekroppen; Følgelig har det vært vanskelig å bare differensiere dem til en ren befolkning av en enkelt celle-type, for eksempel leverceller6.
For å nøyaktig differensiere hPSCs til leverceller, først er det avgjørende å forstå ikke bare hvordan leverceller er spesifisert, men også hvordan ikke-leveren celle-typer utvikle. Kunnskap om hvordan ikke-leverceller utvikler er viktig å logisk undertrykke dannelsen av ikke-leveren linjene under differensiering, og dermed utelukkende guiding hPSCs mot en lever skjebne2. For det andre er det viktig å avgrense flere utviklingsmessige trinn der hPSCs skille mot en lever skjebne. Det er kjent at hPSCs sekvensielt differensiere til flere celle-typer kjent som primitive strek (APS), definitive endoderm (DE), bakre foregut (PFG) og lever knopp forfedre (LB) før forming hepatocytter celler (HEP). Tidligere arbeid avslørte signalene spesifiserer leveren skjebne og signalene som undertrykte dannelsen av alternative ikke-leveren celle-typer (inkludert mage, bukspyttkjertel, og intestinal forfedre) på hver utviklingsmessige avstamning valg2, 7 andre er , 8i den.
Kollektivt, har disse innsikt gitt opphav til en serum-fri, monolag metode for å differensiere hPSCs mot primitive strek, definitive endoderm, bakre foregut, lever knopp forfedre og til slutt, hepatocytter-lignende celler2. Samlet metoden innebærer seeding i hPSCs i en monolag på en passende tetthet, forbereder seks cocktails differensiering Media (som inneholder vekstfaktorer og små molekyler som regulerer ulike utviklingsmessige signalering trasé), og legge til disse mediene sekvensielt for å indusere differensiering i løpet av 18 dager. Under prosessen er det ikke nødvendig med passaging av celler. Av notatet, fordi denne metoden eksplisitt inkluderer signaler som undertrykker dannelsen av ikke-leveren celle-typer, denne differensiering tilnærming1 mer effektivt genererer leveren forfedre og hepatocytter-lignende celler ved sammenligning til bevarte differensiering metoder2,9, 10,11,12. Videre gjør protokollen som er beskrevet i denne teksten, raskere generering av hepatocytter som til slutt uttrykker høyere nivåer av hepatic transkripsjon faktorer og enzymer enn de som er produsert av andre protokoller9,10 , 11 flere , Det er 12.
Protokollen er beskrevet her har visse fordeler fremfor dagens differensiering protokoller. Først innebærer det monolag differensiering av hPSCs, som er teknisk enklere i forhold til tredimensjonale differensiering metoder, slik som de som er avhengige av embryoid organer13. For det andre utnytter denne metoden en fersk forhånd der definitive endoderm celler (en tidlig forløper til leverceller) kan være effektivt og raskt generert innen 2 dager hPSC differensiering2,7, og dermed aktivere den påfølgende produksjon av hepatocytter med økt renhet. Tredje, i sidestilte sammenligninger, den hepatocytter-lignende celler produsert av denne metoden2 produsere mer ALBUMIN og uttrykke høyere nivåer av hepatic transkripsjon faktorer og enzymer i forhold til hepatocytter produsert i andre metoder10, 11,12.
Denne metoden gjør det mulig generering av beriket bestander av lever knopp forfedre, og senere hepatocytter celler, fra hPSCs. Evnen til å generere beriket bestander av menneskelig leverceller er viktig for praktisk utnyttelse av slike celler. Tidligere metoder for å generere hepatocytter fra hPSCs gitt uren celle populasjoner som inneholder både lever og ikke-leverceller som, ved transplantasjon til gnagere, gitt bein og brusk i tillegg til leveren vev15. Derav eksplisitt undertrykkelse av i…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Bing lim for diskusjoner og Stanford Institute for Stem Cell Biology & regenererende medisin for infrastruktur støtte. Dette arbeidet ble støttet av California Institute for regenererende Medicine (DISC2-10679) og Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (til L.T.A. og K.M.L.) og Stanford Beckman Center for Molecular og genetisk Medicine samt anonym, Baxter og DiGenova familier (til K.M.L.).
Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
human Activin | R&D | 338-AC | |
CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
PI103 | Tocris | 2930/1 | |
human FGF2 | R&D | 233-FB | |
DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
C59 | Tocris | 5148 | |
TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |