Effektiv differensiering av Human Pluripotent stamceller i leverceller

Summary

Denne protokollen detaljer en monolag, serum-fri metode for å effektivt generere hepatocytter celler fra humant Pluripotent stamceller (hPSCs) i 18 dager. Dette medfører seks trinn som hPSCs sekvensielt differensiere til mellomliggende celle-typer som primitive strek, definitive endoderm, bakre foregut og lever knopp forfedre før forming hepatocytter celler.

Abstract

Leveren detoxifies skadelige stoffer, utskiller vitale proteiner, og utfører viktige metabolske aktiviteter, og dermed opprettholde livet. Følgelig leversvikt-som kan være forårsaket av kronisk alkoholinntak, hepatitt, akutt forgiftning, eller andre fornærmelser-er en alvorlig tilstand som kan kulminere i blødning, gulsott, koma, og til slutt død. Men tilnærminger til behandling leversvikt, samt studier av leverfunksjon og sykdom, har vært stymied delvis av mangelen på en rikelig tilførsel av menneskelig leverceller. For dette formål, denne protokollen detaljer effektiv differensiering av menneskelige Pluripotent stamceller (hPSCs) i hepatocytter celler, guidet av en utviklingsmessige veikart som beskriver hvordan leveren skjebne er angitt over seks påfølgende differensiering trinn. Ved å manipulere utviklingsmessige signalering veier for å fremme leveren differensiering og eksplisitt undertrykke dannelsen av uønsket celle skjebne, denne metoden genererer effektivt bestander av menneskelig lever knopp forfedre og hepatocytter-lignende celler ved dager 6 og 18 av PSC differensiering, henholdsvis. Dette oppnås gjennom den timelig-presise kontrollen av de utviklingsmessige signal banene, som utøves av små molekyler og vekstfaktorer i et serum fritt kultur medium. Differensiering i dette systemet oppstår i monolagere og gir hepatocytter-lignende celler som uttrykker karakteristiske hepatocytter enzymer og har evnen til å engraft en mus modell av kronisk leversvikt. Evnen til å effektivt generere et stort antall menneskelige leverceller in vitro har forgreninger for behandling av leversvikt, for narkotika screening, og for mekanistisk studier av leversykdom.

Introduction

Formålet med denne protokollen er å effektivt differensiere menneskelige Pluripotent stamceller (hPSCs) i beriket bestander av lever knopp forfedre og hepatocytter celler². Tilgang til en klar tilførsel av menneskelig leveren forfedre og hepatocytter-lignende celler vil akselerere arbeidet med å undersøke leveren funksjon og sykdom og kan aktivere nye cellulære transplantasjon terapi for leversvikt^{3,4, fem}på. Dette har vist seg utfordrende i det siste siden hPSCs (som inkluderer embryonale og indusert Pluripotent stamceller) kan differensiere til alle celle-typer av menneskekroppen; Følgelig har det vært vanskelig å bare differensiere dem til en ren befolkning av en enkelt celle-type, for eksempel leverceller⁶.

For å nøyaktig differensiere hPSCs til leverceller, først er det avgjørende å forstå ikke bare hvordan leverceller er spesifisert, men også hvordan ikke-leveren celle-typer utvikle. Kunnskap om hvordan ikke-leverceller utvikler er viktig å logisk undertrykke dannelsen av ikke-leveren linjene under differensiering, og dermed utelukkende guiding hPSCs mot en lever skjebne². For det andre er det viktig å avgrense flere utviklingsmessige trinn der hPSCs skille mot en lever skjebne. Det er kjent at hPSCs sekvensielt differensiere til flere celle-typer kjent som primitive strek (APS), definitive endoderm (DE), bakre foregut (PFG) og lever knopp forfedre (LB) før forming hepatocytter celler (HEP). Tidligere arbeid avslørte signalene spesifiserer leveren skjebne og signalene som undertrykte dannelsen av alternative ikke-leveren celle-typer (inkludert mage, bukspyttkjertel, og intestinal forfedre) på hver utviklingsmessige avstamning valg^{2, 7} andre er ^{, 8}i den.

Kollektivt, har disse innsikt gitt opphav til en serum-fri, monolag metode for å differensiere hPSCs mot primitive strek, definitive endoderm, bakre foregut, lever knopp forfedre og til slutt, hepatocytter-lignende celler². Samlet metoden innebærer seeding i hPSCs i en monolag på en passende tetthet, forbereder seks cocktails differensiering Media (som inneholder vekstfaktorer og små molekyler som regulerer ulike utviklingsmessige signalering trasé), og legge til disse mediene sekvensielt for å indusere differensiering i løpet av 18 dager. Under prosessen er det ikke nødvendig med passaging av celler. Av notatet, fordi denne metoden eksplisitt inkluderer signaler som undertrykker dannelsen av ikke-leveren celle-typer, denne differensiering tilnærming¹ mer effektivt genererer leveren forfedre og hepatocytter-lignende celler ved sammenligning til bevarte differensiering metoder^{2,9, 10,11,12}. Videre gjør protokollen som er beskrevet i denne teksten, raskere generering av hepatocytter som til slutt uttrykker høyere nivåer av hepatic transkripsjon faktorer og enzymer enn de som er produsert av andre protokoller^{9,10 , 11} flere ^, Det er ¹².

Protokollen er beskrevet her har visse fordeler fremfor dagens differensiering protokoller. Først innebærer det monolag differensiering av hPSCs, som er teknisk enklere i forhold til tredimensjonale differensiering metoder, slik som de som er avhengige av embryoid organer¹³. For det andre utnytter denne metoden en fersk forhånd der definitive endoderm celler (en tidlig forløper til leverceller) kan være effektivt og raskt generert innen 2 dager hPSC differensiering^2,7, og dermed aktivere den påfølgende produksjon av hepatocytter med økt renhet. Tredje, i sidestilte sammenligninger, den hepatocytter-lignende celler produsert av denne metoden² produsere mer ALBUMIN og uttrykke høyere nivåer av hepatic transkripsjon faktorer og enzymer i forhold til hepatocytter produsert i andre metoder^{10, 11,12}.

Protocol

1. utarbeidelse av differensiering Media Merk: Se tabellen over materialer for produsent informasjon om materialer og reagenser som brukes. Tilberedning av basis kjemisk definerte medier (CDM)Merk: CDM2, CDM3, CDM4 og CDM5 er kjemisk definerte medier som brukes som base medier for å skille hPSCs til leverceller på ulike stadier. Sammensetningen av disse mediene finnes i tabell 1. For å gjøre CDM2 ell…

Representative Results

Etter 24 h av APS differensiering, vil koloniene generelt vedta en annen morfologi enn udifferensierte kolonier samtidig med et tap av den lyse grensen som typisk omslutter hPSC kolonier. Morfologisk, primitive strek celler generelt har fillete grenser og er mer spredt og mindre kompakt enn hPSCs-dette er stemningsfull av en epitel-til-mesenchymal overgang som pluripotent epiblast celler differensiere og inntrengning i primitive stripe in vivo. Hvis kolonien størrelsen på hPSCs før dif…

Discussion

Denne metoden gjør det mulig generering av beriket bestander av lever knopp forfedre, og senere hepatocytter celler, fra hPSCs. Evnen til å generere beriket bestander av menneskelig leverceller er viktig for praktisk utnyttelse av slike celler. Tidligere metoder for å generere hepatocytter fra hPSCs gitt uren celle populasjoner som inneholder både lever og ikke-leverceller som, ved transplantasjon til gnagere, gitt bein og brusk i tillegg til leveren vev¹⁵. Derav eksplisitt undertrykkelse av i…

Materials

Geltrex	Thermofisher Scientific	A1569601
1:1 DMEM/F12	Gibco	11320033
0.2 μm pore membrane filter	Millipore	GTTP02500
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850
Thiazovivin	Tocris Bioscience	3845
Accutase	Gibco or Millipore	Gibco A11105, Millipore  SCR005
IMDM, GlutaMAX™ Supplement	Thermofisher Scientific	31980030
Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement	Thermofisher Scientific	31765035
KOSR, Knockout serum replacement	Thermofisher Scientific	10828028
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich	P8136
Transferrin	Sigma-Aldrich	10652202001
Chemically Defined Lipid Concentrate	Thermofisher Scientific	11905031
human Activin	R&D	338-AC
CHIR99201	Tocris	4423
PI103	Tocris	2930/1
human FGF2	R&D	233-FB
DM3189	Tocris	6053/10
A83-01	Tocris	2939/10
Human BMP4	R&D	314-BP
C59	Tocris	5148
TTNPB	Tocris	0761/10
Forskolin	Tocris	1099/10
Oncostatin M	R&D	295-OM
Dexamethasone	Tocris	1126
Ro4929097	Selleck Chem	S1575
AA2P	Cayman chemicals	16457
human recombinant Insulin	Sigma-Aldrich	11061-68-0