Examen cuantitativo de susceptibilidad antibiótica de Neisseria gonorrhoeae utilización del ATP utilizando agregados comerciales ensayos y manchas de vivos/muertos
Summary
Un simple análisis de la medición de ATP y live/dead tinción fueron utilizados para cuantificar y visualizar Neisseria gonorrhoeae supervivencia después del tratamiento con ceftriaxona. Este protocolo puede ser extendido para examinar los efectos antimicrobianos de cualquier antibiótico y puede usarse para definir la concentración inhibitoria mínima de antibióticos en biopelículas bacterianas.
Abstract
La aparición de resistencia a antibióticos Neisseria gonorrhoeae (GC) es una amenaza para la salud en todo el mundo y destaca la necesidad de identificar a las personas que no tratamiento. Esta bacteria gram negativa causa gonorrea exclusivamente en los seres humanos. Durante la infección, son capaces de formar agregados o biofilms. La prueba de la concentración mínima inhibitoria (CMI) se utiliza para determinar la susceptibilidad a los antibióticos y para definir el tratamiento adecuado. Sin embargo, se desconoce el mecanismo de la erradicación en vivo y su relación con resultados de laboratorio. Se desarrolló un método que examina cómo la agregación GC afecta la sensibilidad a los antibióticos y muestra la relación entre el tamaño total y sensibilidad a los antibióticos. Cuando agregado de GC, son más resistentes a los antibióticos matanza, con las bacterias en el centro de sobrevivir ceftriaxona tratamiento mejor que los de la periferia. Los datos indican que la agregación de N. gonorrhoeae puede reducir su susceptibilidad a la ceftriaxona, que no se ve reflejado mediante los métodos de micro basados en placa de agar estándar. El método utilizado en este estudio permitirá a los investigadores probar susceptibilidad bacteriana bajo condiciones clínicamente relevantes.
Introduction
La gonorrea es que una común de transmisión sexual de infecciones (ITS)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), una bacteria gram negativa de la diplococcal, es el agente causal de esta enfermedad. Los síntomas de la infección genital pueden resultar en dolor durante la micción, generalizado dolor genital y secreción uretral. La infección suele ser asintomática2,3,4,5, y esto permite la colonización extendida. Estas infecciones no tratadas son un problema de salud importante, ya que tienen el potencial para facilitar la transmisión del organismo y esto puede llevar a complicaciones como enfermedad pélvica inflamatoria (EPI) y diseminada infección gonocócica (DGI)6. Gonorrea resistente a los antibióticos es una crisis de salud pública importante y un aumento de la carga socioeconómica7. Reducida susceptibilidad a las cefalosporinas ha producido cambio de régimen de tratamiento de un antibiótico único a la terapia dual, que combina la azitromicina o doxiciclina con ceftriaxona8. El mayor fracaso de ceftriaxona y azitromicina9,10, en combinación con infecciones asintomáticas, destaca la necesidad de entender los fracasos de tratamiento de la gonorrea.
La prueba de la concentración mínima inhibitoria (CMI), incluyendo agar dilución y disco pruebas de difusión, se ha utilizado como la prueba médica estándar para la identificación de resistencia a un antibiótico. Sin embargo, no está claro si la prueba MIC refleja resistencia antibiótica bacteriana in vivo. La formación de biofilms bacterianos contribuye a la supervivencia de las bacterias en presencia de concentraciones bactericidas de antibiótico: la prueba de MIC es incapaz de detectar este efecto11. Porque la GC puede formar biofilms en superficies de la mucosa12, presumimos que antibiótico susceptibilidad dentro de agregados sería distinta al visto en GC individual. Además, los estudios han demostrado que las moléculas de superficie variable, Pili, opacidad asociada a proteina (Opa) de tres fases, y lipooligosaccharides (LOS), que regulan las interacciones entre bacterias, conducen a diferentes agregados tamaño13, 14 , 15. la contribución de estos componentes para resistencia a los antibióticos no ha sido examinada por la falta de métodos adecuados.
Actualmente, existen varios métodos para medir la eliminación del biofilm. El método cuantitativo más utilizado es mediante la medición de los cambios en la biomasa usando cristal violeta16la coloración. Sin embargo, el método requiere manipulación experimental importante, que potencialmente puede generar errores en el experimento se repite17. El método de coloración en vivo/muerto aquí permite la visualización de bacterias vivas y muertas y su distribución dentro de la biopelícula. Sin embargo, la estructura del biofilm puede plantear como una barrera física que reduce la penetración del tinte. Por lo tanto, para cuantificar las bacterias muertas o vivir dentro de un grupo, la tinción se limita a pequeñas biofilms o su precursor microcolonias o agregaciones. Otros métodos, incluyendo los agar dilución y disco pruebas de difusión, no son capaces de medir los efectos de la agregación. Para examinar la susceptibilidad de la GC dentro de la agregación después de la exposición a antibióticos, un método ideal necesitan tener tanto un ensayo que puede medir viven bacterias y visualizar su distribución.
El procedimiento descrito aquí combina una medida de la utilización del ATP y un vivo/muerto tinción análisis cuantitativo a y examinar visualmente la susceptibilidad de la GC dentro de agregados en presencia de antibióticos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las bacterias pueden formar biofilms durante la infección del ser humano. Prueba de MIC tradicionales puede no reflejar la concentración necesaria para erradicar las bacterias de la biopelícula. Para probar efectos antimicrobianos en un biofilm, métodos basados en la biomasa de biofilm como unidades formadoras de colonias de la galjanoplastia pueden ser erróneos debido al impacto de la estructura del biofilm. Por ejemplo, el método de placas sólo funciona si el biofilm puede ser interrumpido. Por lo tanto, la UFC …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional de salud para D.C.S. y W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., y E.N. fueron apoyadas en parte o participar en el programa “La experiencia y de investigación primer año innovación” financiado por la Universidad de Maryland. Los fundadores no tenían ningún papel en el estudio de diseño, recopilación de datos y análisis, decisión de publicar o preparación del manuscrito. Reconocemos el UMD CBMG Imaging Core para todos los experimentos de microscopía.
Materials
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
Referências
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