Webbplats riktad mutagenes för In Vitro och i Vivo experiment exemplifieras med RNA interaktioner i Escherichia Coli

Summary

Webbplats riktad mutagenes är en teknik som används för att införa specifika mutationer i deoxiribonukleinsyra (DNA). Det här protokollet beskriver hur man gör webbplats riktad mutagenes med en 2-steg och 3-stegs polymeras-kedjereaktion (PCR) baserat tillvägagångssätt som är tillämpliga på alla DNA-fragment av intresse.

Abstract

Webbplats riktad mutagenes är en teknik som används för att införa specifika mutationer i DNA att undersöka samspelet mellan små icke-kodande ribonukleinsyra (sRNA) molekyler och målet messenger-RNA (mRNA). Dessutom används webbplats riktad mutagenes att mappa specifika protein bindningsställen till RNA. En 2-steg och 3 PCR-baserade införandet av mutationer beskrivs. Metoden är relevant för alla protein-RNA och RNA-RNA interaktionsstudier. Kort sagt, bygger tekniken på utforma grundfärger med den önskade Function”-mutation(er), och genom 2 eller 3 steg av PCR syntetisera en PCR produkt med mutationen. PCR-produkten används sedan för kloning. Här beskriver vi hur du utför webbplats riktad mutagenes med både 2 – och 3-stegs metoden att introducera mutationer i sRNA, McaS och mRNA, csgD, att undersöka RNA-RNA och RNA-protein interaktioner. Vi tillämpar denna teknik för att undersöka RNA interaktioner; tekniken är dock tillämpliga på alla mutagenes studier (t.ex. DNA-protein interaktioner, aminosyra ersättning/borttagning/tillägg). Det är möjligt att införa någon typ av mutation utom icke naturliga baser men tekniken är endast tillämplig om en PCR-produkten kan användas för efterföljande ansökan (t.ex. kloning och mall för ytterligare PCR).

Introduction

DNA benämns ofta som blåkopian för en levande cell eftersom alla strukturer i cellen är kodade i sekvensen av dess DNA. Exakt replikering och DNA-reparationsmekanismer säkerställa att endast mycket låga priser av mutationer förekommer, vilket är viktigt för att upprätthålla rätt funktioner kodade gener. Förändringar i DNA-sekvensen kan påverka efterföljande funktioner på olika nivåer börjar med DNA (erkännande av transkriptionsfaktorer och restriktionsenzym), sedan RNA (baspar komplementaritet och sekundärt strukturera förändringar) och/eller protein (aminosyror sura substitutioner, borttagningar, tillägg eller ram-skift). Medan många mutationer inte påverkar geners funktion väsentligt, kan vissa mutationer i DNA har enorma konsekvenser. Således, webbplats riktad mutagenes är ett värdefullt verktyg för att studera betydelsen av specifika DNA webbplatser på alla nivåer.

Det här protokollet beskriver en riktad mutagenes strategi används för att införa specifika mutationer. Protokollet bygger på två olika PCR strategier: en 2-steg eller en 3-stegs PCR. 2-stegs PCR är tillämplig om önskad mutationen är nära slutet 5′ eller 3′ ände DNA av intresse (< 200 baspar (bp) från slutet) och 3-stegs PCR är tillämplig i alla fall.

I 2-steg närma sig PCR, 3 grundfärger är utformade, där en uppsättning primers är utformad för att förstärka DNA av intresse (grundfärger 1 och 3, framåt och bakåt, respektive), och en enda primer är utformad för att inkorporera mutationen. Mutationen att införa grundfärg (primer 2) bör ha en omvänd läggning om mutationen är nära slutet 5′ och en framåt orientering om mutationen är nära slutet 3′. I det första steget för PCR förstärker primer 1 + 2 eller 2 + 3 ett litet fragment nära 5′ slutet eller 3′ slutet, respektive. PCR-produkten används sedan som en primer i steg två med primer 1 eller 3, vilket resulterar i en PCR-produkt med en mutation i DNA av intresse (figur 1A).

I 3-steg PCR, 4 primers är utformade, där en uppsättning primers är utformad för att förstärka DNA av intresse (grundfärger 1 och 4, framåt och bakåt, respektive) och en uppsättning primers är utformad för att inkorporera specifika mutationer med överlappande komplementaritet (primers 2 och 3, bakåt och framåt, respektive). I steg ett och två, grundfärger 1 + 2 och 3 + 4 förstärker 5′ och 3′ slutet. I steg tre, de resulterande PCR produkterna från steg ett och två används som mallar och förstärks med grundfärg 1 + 4. PCR-produkten alltså DNA av intresse med önskad mutationen (figur 1B).

Medan muterad DNA kan användas för alla efterföljande program, beskriver det här protokollet hur du kombinerar nytt DNA i en kloning vektor. Användningen av kloning vektorer har flera fördelar såsom användarvänlighet kloning och specifika experimentella tillämpningar beroende på funktioner av vektorn. Den här funktionen används ofta för RNA interaktionsstudier. En annan teknik för RNA interaktionsstudier är strukturella sondering av RNA i komplex med en annan RNA^1,2 eller protein^3,4. Men utförs strukturella sondera endast in vitro-medan webbplats riktad mutagenes och efterföljande kloning tillåter interaktionsstudier in vivo.

Webbplats riktad mutagenes har i stor utsträckning använts för RNA interaktionsstudier som presenteras här. Men den viktigaste metoden angående 2 – eller 3-steg PCR är tillämplig på någon bit av DNA och därmed inte bara begränsat till RNA-interaktionsstudier.

För att exemplifiera tekniken och dess möjliga användningsområden, används karakterisering av regioner som är viktiga för post-transcriptional reglering av mRNA, csgD, av Escherichia coli (E. coli). E. coli, csgD riktas av små icke-kodande RNA, McaS, i samarbete med ett protein, Hfq, att förtränga protein-uttryck av CsgD^2,4,5. Tekniken används för att introducera mutationer att regionen base-ihopkoppling mellan csgD och McaS och Hfq bindande platsen för csgD. Den erhållna DNA är sedan klonade in en vektor som lämpar sig för efterföljande experiment. Nedströms tillämpningar av tekniken inkluderar både in vivo och in vitro-experiment. För illustration, exempel 1 kännetecknas i vivo med en western blot-analys och exempel 2 kännetecknas in vitro-med en elektroforetiska mobilitet Skift-analys (EMSA). I båda fallen är det illustrerade hur platsen riktad mutagenes kan användas i kombination med andra tekniker för att göra biologiska slutsatser om en gen av intresse.

Protocol

1. vector urval Välja en vektor att utföra nedströms experiment med. Varje vektor är tillämplig för denna 2 – och 3-stegs PCR-metod. Baserat på valet av vektor, välja lämpliga restriktionsenzym för kloning. 2. primer design för webbplatsen riktad mutagenes Välja mellan antingen 2-steg eller 3 PCR-strategin (2-steg är endast för mutationer < 200 bp från vardera änden av DNA av intresse). För 2-stegs PCR, gå till steg 2.2 och 3-stegs PCR går…

Representative Results

Att undersöka RNA interaktioner angående post-transcriptional reglering av csgD, en dubbel vektor setup valdes: en att uttrycka den csgD mRNA och en annan för att uttrycka små icke-kodande RNA, McaS. csgD var klonade in pBAD33, som är en arabinos inducerbara medium-kopia plasmid med kloramfenikol motstånd och McaS var klonade in mini R1-pNDM220, som är en isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inducerbara låg kopia plasmid med ampicillin-resistens…

Discussion

Webbplats riktad mutagenes har ett brett utbud av olika program, och här, representativa resultat från en in vivo och in vitro-experiment ingick som exempel på hur man gör biologiska slutsatser med hjälp av tekniken. Webbplats riktad mutagenes har länge varit den gyllengula standarden för RNA interaktionsstudier. Styrkan i tekniken ligger i kombinationen av att införa relevanta mutationer med efterföljande analyser och experiment (western blot eller EMSA) att dra slutsatser om specifika DNA webbplatser och deras…

Materials

Anti-GroEL antibody produced in rabbit	Merck	G6532	Primary antibody
Azure c200	Azure	NA	Gel imaging workstation
Custom DNA oligo	Merck	VC00021
DeNovix DS-11	DeNovix	NA	Spectrophotometer for nucleic acid measurements
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Scientific	R0611
Ethidium bromide solution 1 %	Carl Roth	2218.1
GeneJET Gel Extraction Kit	Thermo Scientific	K0691
GeneRuler DNA Ladder Mix	Fermentas	SM0333
Gerard GeBAflex-tube Midi	Gerard Biotech	TO12	Dialysis tubes for electro elution
MEGAscript T7 Transcription Kit	Invitrogen	AM1334
Mini-Sub Cell GT Cell	Bio-Rad	1704406	Horizontal electrophoresis system
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse	Merck	F3165	Primary antibody
Mouse Immunoglobulins	Dako Cytomation	P0447	HRP conjucated secondary antibody
NucleoSpin miRNA	Macherey Nagel	740971	RNA purification
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Scientific	NP0323BOX	Bis-Tris gels for protein separation
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs	M0531S	DNA polymerase
PowerPac HC High-Current Power Supply	Bio-Rad	1645052
Rabbit Immunoglobulins	Dako Cytomation	P0448	HRP conjucated secondary antibody
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
SigmaPlot	Systat Software Inc	NA	Graph and data analysis software tool
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096	PCR machine
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202	Ligase
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201S
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X)	Thermo Scientific	B49