Summary

Deteção de imunoglobulina Antiaquaporina-4 G de soro humano por ensaio baseados em células

Published: April 05, 2019
doi:

Summary

Baseada em célula de ensaio é um método amplamente utilizado para detectar imunoglobulina de soro antiaquaporina-4 G. Esse método pode ser aplicado para o diagnóstico clínico e pesquisas científicas de transtornos do espectro óptico Neuromielite.

Abstract

Antiaquaporina-4 (AQP4) Imunoglobulina G (IgG) é o biomarcador de núcleo diagnóstico para transtornos do espectro do Neuromielite optica (NMOSD). O ensaio de baseada em célula (CBA) é um método amplamente utilizado para detectar IgG anti-AQP4 no soro humano com alta sensibilidade e especificidade. Brevemente, soro anti-AQP4 IgG é capturado pela célula AQP4-transfectadas que é fixada sobre o biochip então detectada por um anticorpo secundário marcado com fluoresceína. Microscopia de fluorescência é utilizada para visualizar a fluorescência, e a intensidade da fluorescência é avaliada pelo menos dois médicos experientes. Um diagnóstico final de NMOSD pode ser feito com base na combinação de resultados de deteção de IgG anti-AQP4, manifestações clínicas e achados neurorradiológica. De acordo com estudos anteriores, a CBA é mais sensível e específica do que outros métodos de deteção de IgG anti-AQP4, e pode ser aplicada para diagnóstico clínico e estudos de NMOSD. O método tem limitações; por exemplo, a escala internacional para avaliar a concentração de IgG do soro anti-AQP4 é ainda insuficiente. Aqui, um protocolo detalhado para a deteção de IgG anti-AQP4 soro humano usando CBA é descrito.

Introduction

Soro AQP4 IgG é um biomarcador de diagnóstico de núcleo para Neuromielite optica espectro transtornos (NMOSD)1. O ensaio de baseada em célula (CBA) é um método de deteção de IgG anti-AQP4 amplamente utilizado com alta sensibilidade e especificidade. Aqui, um protocolo detalhado para a CBA é introduzido.

AQP4, uma proteína de canal de água, possui seis unidades de membrana que mede e dois domínios helicoidais em torno um aquosa pore2. IgG anti-AQP4 está envolvida na patogênese da NMOSD por meio de ligação ao seu alvo AQP4, que situa-se principalmente sobre o endfeet de astrócitos3. Tem sido demonstrado que IgG anti-AQP4 é positivo em cerca de dois terços dos pacientes NMOSD4. Nos mais recentes critérios diagnósticos internacionais para NMOSD, IgG anti-AQP4 é considerado ser um biomarcador diagnóstico do núcleo5. A este respeito, é fundamental estabelecer um protocolo confiável para detectar soro humano IgG anti-AQP4 e facilitar o diagnóstico clínico de NMOSD.

Atualmente, vários métodos de deteção de IgG anti-AQP4 estão disponíveis, tais como a CBA, ensaio baseado em tecido, ensaio imunoenzimático e citometria de fluxo6,7. CBA emprega EU90 células, que são transfected com AQP4 humano, para capturar IgG anti-AQP4. O IgG anti-AQP4 capturado é detectado pelos anticorpos secundários fluorescentes e posteriormente visualizado por microscopia. Acumular evidências tem mostrado que a CBA é mais sensível e específico do que outros anti-AQP4 IgG deteção métodos6,7. De acordo com uma meta-análise, a sensibilidade e especificidade do CBA foram mostrados para ser de 76% e 99%, que eram superiores baseados em tecido e ensaios de enzima-lig da imunoabsorção6. Além disso, uma comparação multicêntrico de ensaios de diagnósticos de IgG anti-AQP4 foi realizado7. Um total de 193 estudo sujeitos de 15 centros de diagnósticos europeus foram matriculados7. Quatro diferentes métodos foram utilizados para detectar soro de IgG anti-AQP47. Foi demonstrado que a CBA foi mais sensível e específico do que os outros métodos7. Como AQP4 é expressa em duas isoformas principais (AQP4-M1 e M23-AQP4), célula de captura de IgG anti-AQP4 é transfectada com AQP4-M1 ou AQP4-M23. No entanto, o tipo de célula de captura é melhor permanece controverso. Uma investigação apoiou AQP4-M1 baseado CBA8, enquanto outros têm indicado que AQP4-M23 baseado CBA é melhor7,9,10. No entanto, CBA AQP4 M23-baseados pode produzir resultados falso-positivos devido a inespecíficos IgG ligação8. Jarius et al.. 11 relataram que não houve significativa diferença em taxas de detecção de IgG anti-AQP4 entre AQP4-M1 e CBAs AQP4-M23-baseado.

Em resumo, soro anti-AQP4 IgG é um biomarcador de núcleo para NMOSD. CBA tem maior especificidade e sensibilidade que outros métodos de deteção de IgG anti-AQP4. Permanece controverso se AQP4-M1-AQP4 M23-baseado ou CBA é melhor. Neste artigo, um protocolo detalhado para a CBA AQP4 M1-baseada é descrito, que pode aplicar para o diagnóstico clínico e estudos de NMOSD.

Protocol

Este procedimento foi aprovado pelo Comitê de ética da Universidade primeiro Hospital de Jilin e realizou-se em aproximadamente 1.500 indivíduos. 1. se o paciente registro e coleta de amostra de sangue Aplica a detecção laboratorial de soro de que IgG anti-AQP4 aos pacientes da clínica com os principais queixas e sintomas listado abaixo. Realize exames físicos também.Neurite óptica: pacientes sofrem com déficits visuais, tais como a perda dos campos visuais e reduç…

Representative Results

Usando o procedimento descrito aqui, anti-AQP4 específicos IgG no soro é detectável. Durante o procedimento, pre-diluídas amostras, um controle positivo e um controle negativo foram adicionados aos campos de reação, que contêm áreas transfectadas e untransfected (Figura 2). Fluorescência do controlo negativo numa área transfectada indicado principalmente a vinculação não específico do anticorpo secundário às células transfectadas em biochips …

Discussion

Descrevemos um método amplamente acessível para detectar IgG anti-AQP4 no soro humano. IgG anti-AQP4 está intimamente relacionado com NMOSD, e que estabelece um método de deteção de IgG anti-AQP4 confiável é fundamental para o diagnóstico clínico de NMOSD. Primeiro, o IgG anti-AQP4 é específico para NMOSD. Esclerose múltipla é também uma doença imune-mediada do sistema nervoso central e compartilha muitas semelhanças com NMOSD12. No entanto, o IgG anti-AQP4 só é positivo em NMOS…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores são gratos pelo apoio de subsídios da Fundação Nacional de Ciências da China (n. º 31600820), a saúde e Comissão planejamento familiar da província de Jilin (não 2016Q036) e a ciência e tecnologia planejamento projeto da província de Jilin (n. º 20180520110JH).

Materials

Anti-aquaporin-4 IIFT Euroimmun FA 1128-2005-50 Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium. 
CellSens Dimension OLYMPUS N/A photograph software
Gel & clot activator tube Improve medical 623040202 From a local Chinese company

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Citar este artigo
Liu, C., Zhu, M., Wang, Y. Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay. J. Vis. Exp. (146), e59014, doi:10.3791/59014 (2019).

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