En musmodell att bedöma medfödda immunsvaret mot Staphylococcus aureus -infektion
Summary
Ett tillvägagångssätt beskrivs för realtid detektering av medfödda immunsvaret mot kutan såra och Staphylococcus aureus infektion av möss. Genom att jämföra LysM-andra möss (som äger fluorescerande neutrofiler) med en LysM-andra korsavlade nedsatt immunförsvar mus stam, vi i förväg vår förståelse av infektion och utveckling av metoder för att bekämpa infektion.
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) infektioner, inklusive meticillinresistenta fläckar, är en enorm belastning på sjukvården. Med incidensen av S. aureus infektion klättring årligen, finns det en efterfrågan på ytterligare forskning i dess patogenicitet. Djurmodeller av smittsam sjukdom avancera vår förståelse av värd-patogen svar och leda till utveckling av effektiva therapeutics. Neutrofiler har en primär roll i det medfödda immunsvaret som styr S. aureus infektioner genom att bilda en böld för att skärma av infektionen och underlätta bakteriell clearance; antalet neutrofiler som infiltrerar en S. aureus hudinfektion ofta korrelerar med sjukdom resultatet. LysM-andra möss, som äger förbättrade grönt fluorescerande protein (andra) infogas i regionen lysozym M (LysM) arrangören (uttryckt primärt av neutrofiler), när den används tillsammans med i vivo hela djur fluorescens imaging (FLI) ger en sätt att kvantifiera neutrofila emigration noninvasivt och longitudinellt in skadade huden. När de kombineras med en självlysande S. aureus -stam och sekventiell Invivo hela djur självlysande tänkbar (BLI), det är möjligt att longitudinellt övervaka både neutrofila rekrytering dynamics och i vivo bakteriella börda på platsen för infektion hos sövda möss från uppkomsten av infektion till upplösning eller död. Möss är mer motståndskraftiga mot ett antal virulensfaktorer som produceras av S. aureus som underlättar effektiv kolonisation och infektion hos människa. Nedsatt immunförsvar möss ger en känsligare djurmodell för att undersöka ihållande S. aureus infektioner och therapeutics förmåga att öka medfödda immunsvar. Häri, karakterisera vi svar i LysM-andra möss som har fötts till MyD88-brist möss (LysM-andra × MyD88– / – möss) tillsammans med vildtyp LysM-andra möss att undersöka S. aureus hud sårinfektion. Multispektrala samtidiga upptäckt aktiverade studie av neutrofila rekrytering dynamik med hjälp av Invivo FLI, bakteriell belastning med hjälp av Invivo BLI, och sårläkning längdriktningen och noninvasivt över tid.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) står för majoriteten av hud- och mjukdelsinfektioner (ssti) i USA1. Förekomsten av meticillinresistenta S. aureus (MRSA) infektioner har ökat stadigt under de senaste två decennier2, motivera studiet av mekanismerna för persistens och upptäckten av nya behandlingsstrategier. Vårdstandard för MRSA-infektioner är systemisk antibiotikabehandling, men MRSA har blivit allt mer resistenta mot antibiotika över tid3 och dessa läkemedel kan minska värdens fördelaktigt microbiom, orsakar negativa hälsoeffekter, särskilt i barn4. Prekliniska studier har undersökt alternativa strategier för att behandla MRSA infektioner5, men att översätta dessa synsätt till kliniken har bevisat utmanande på grund av uppkomsten av virulensfaktorer som omintetgöra värd immunsvar6. För att dissekera värd-patogen dynamik som driver S. aureus mjukdelsinfektioner, vi kombinerar noninvasiv och längsgående avläsning av antalet neutrofiler rekryteras till såret sängen med kinetic åtgärder av bakteriell överflöd och såryta.
Neutrofiler är den vanligast förekommande cirkulerande Leukocyten hos människor och de första responders till en bakteriell infektion7. Neutrofiler är en nödvändig komponent för en effektiv värdrespons mot S. aureus infektioner på grund av deras bakteriedödande mekanismer, inbegripet produktion av reaktiva syreradikaler, proteaser, antimikrobiella peptider och funktionella Svaren inklusive fagocytos och neutrofila extracellulära fälla produktion8,9. Mänskliga patienter med genetiska defekter i neutrofil funktion, till exempel kronisk granulomatös sjukdom och Chediak-Higashi syndromet, visar en ökad mottaglighet för S. aureus infektion. Dessutom, patienter med genetiska (såsom kongenital neutropeni) och förvärvade (t.ex. neutropeni hos patienter som får cytostatika) defekter i neutrofila siffror också är mycket mottagliga för S. aureus infektion10. Med tanke på vikten av neutrofiler i clearing S. aureus infektioner, kan förbättra deras immun kapacitet eller trimma sina siffror inom en S. aureus lesion vara en effektiv strategi för att lösa infektion.
Under det senaste årtiondet, har transgena möss med fluorescens neutrofila reportrar utvecklats för att studera deras människohandel11,12. Att kombinera neutrofila reporter möss med hela djur avbildningstekniker tillåter spatiotemporal analys av neutrofiler i vävnader och organ. Kombination med självlysande stammar av S. aureus, det är möjligt att spåra ansamling av neutrofiler i svar till S. aureus överflöd och uthållighet i samband med bakteriell virulens faktorer som direkt och indirekt stör neutrofila nummer i drabbade vävnaden13,14,15,16.
Möss är mindre mottagliga för S. aureus virulens och immune evasion mekanismer än människor. Som sådan, vildtyp möss inte kan vara en idealisk djurmodell att undersöka effekten av en tanke terapeutiska att behandla kronisk S. aureus infektion. MyD88-brist möss (dvs, MyD88– / – möss), en immunkomprometterade mus stam som saknar funktionell interleukin-1 receptor (IL-1R) och Toll-liknande receptorer (TLR) signalering, Visa större känslighet för S. aureus infektion jämfört vildtyp möss17 och en nedskrivning i neutrofila människohandel till en plats av S. aureus infektion i huden18. Utveckling av en mus stam som äger en fluorescerande neutrofila reporter i MyD88– / – möss har lämnat en alternativ modell för att undersöka effekten av terapier att behandla S. aureus -infektion jämfört med nuvarande antal neutrofila reporter möss.
I detta protokoll, vi karakterisera S. aureus -infektion hos immunsupprimerade LysM-andra × MyD88– / – möss och jämföra tidsförlopp och upplösning av infektion med LysM-andra möss. LysM-andra × MyD88– / – möss utvecklar en kronisk infektion som inte försvinner, och 75% duka till infektion efter 8 dagar. En betydande brist i inledande neutrofila rekrytering sker över 72 h den inflammatoriska fasen av infektion, och 50% färre neutrofiler rekrytera under det senare skedet av infektionen. Ökad känslighet av den LysM-andra × MyD88– / – möss gör detta särskild stam en rigorös preklinisk modell för att utvärdera effekten av nya terapeutiska tekniker inriktning S. aureus -infektion jämfört med nuvarande modeller som utnyttja vildtyp möss, speciellt tekniker som syftar till att öka medfödda immunsvaret mot infektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
S. aureus infektion modeller som utnyttjar självlysande S. aureus infektion i en fluorescerande neutrofila reporter mus tillsammans med avancerade tekniker i hela djur Invivo optisk imaging har avancerade vår kunskap om den medfödda immunsvar mot infektion. Tidigare studier med LysM-andra musen har visat att upp till 1 x 107 neutrofiler rekrytera till ett S. aureus infekterade sår under de första 24 h av infektion14och sår-rekryteras neutrofiler utöka s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av nationella institut för hälsa bidrag R01 AI129302 (till S.I.S.) och programmet utbildning i farmakologi: från bänken till säng vid UC Davis (NIH T32 GM099608 till L.S.A). Den molekylära och genomisk Imaging (CMGI) vid University of California Davis gav fantastiskt tekniska stöd.
Materials
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | .35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
Referências
- Moran, G. J., et al. Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department. New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).
- Suaya, J. A., et al. Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Blaser, M. J. Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science. 352 (6285), 544-545 (2016).
- Hilliard, J. J., et al. Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).
- Proctor, R. A. Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges. European Cells & Materials. 30, 315-326 (2015).
- Mölne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from Marrow to Microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Miller, L. S., Cho, J. S. Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections. Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Falahee, P. C., et al. α-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds. Journal of immunology. 199 (5), 1772-1782 (2017).
- Kim, M. -. H., et al. Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging. Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).
- Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation. Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).
- Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).
- Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection. The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).
- Miller, L. S., et al. MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus. Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).
- Macedo, L., et al. Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors. The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).
- Granick, J. L., et al. Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds. Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).
- Foster, T. J. Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).
- Gordon, R. J., Lowy, F. D. Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection. Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).
- Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging. PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).
- Dillen, C. A., et al. Clonally expanded γδ T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).
