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Cancer Research

अनुदैर्ध्य रूपात्मक और तीन आयामी ट्यूमर की शारीरिक निगरानी Spheroids ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी का उपयोग

Published: February 09, 2019
doi:
10.3791/59020
, , , , , , , , , , , , ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 2Department of Mechanical Engineering,Lehigh University, 3Department of Biomedical Engineering,Southern University of Science and Technology, 4Department of Technology R&D,Nexcelom Bioscience LLC, 5Department of Bioengineering,Lehigh University, 6Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University

Summary

ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (OCT), एक तीन आयामी इमेजिंग प्रौद्योगिकी, पर नजर रखने और कोशिकीय ट्यूमर spheroids के विकास कैनेटीक्स विशेषताएं इस्तेमाल किया गया था । ट्यूमर spheroids का सटीक volumetric ठहराव एक voxel गिनती दृष्टिकोण का उपयोग कर, और spheroids में लेबल से मुक्त मृत ऊतक का पता लगाने आंतरिक ऑप्टिकल क्षीणन कंट्रास्ट के आधार पर, प्रदर्शन किया गया ।

Abstract

ट्यूमर spheroids एक तीन आयामी (3 डी) कैंसर अनुसंधान और विरोधी कैंसर दवा खोज में सेल संस्कृति मॉडल के रूप में विकसित किया गया है । हालांकि, वर्तमान में, उच्च प्रवाह इमेजिंग मोडलें उज्ज्वल क्षेत्र या प्रतिदीप्ति डिटेक्शन का उपयोग, सीमित प्रकाश प्रवेश के कारण ट्यूमर अंडाकार आकृति के समग्र 3d संरचना को हल करने में असमर्थ हैं, फ्लोरोसेंट रंगों का प्रसार और गहराई-संपति । हाल ही में, हमारी प्रयोगशाला ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (OCT), एक लेबल मुक्त और गैर विनाशकारी 3 डी इमेजिंग रूपरेखा, एक ९६-अच्छी तरह से थाली में कोशिकीय ट्यूमर spheroids के अनुदैर्ध्य लक्षण वर्णन प्रदर्शन के उपयोग का प्रदर्शन किया । OCT 3d रूपात्मक और ट्यूमर की शारीरिक जानकारी प्राप्त करने में सक्षम था spheroids ऊंचाई में लगभग ६०० µm तक बढ़ रहा है । इस अनुच्छेद में, हम एक उच्च प्रवाह oct (एचटी-अक्टूबर) इमेजिंग प्रणाली है कि पूरी बहु अच्छी तरह से प्लेट स्कैन और 3 डी ट्यूमर spheroids के अक्टूबर डेटा स्वचालित रूप से प्राप्त करता है प्रदर्शन । हम प्रोटोकॉल में एचटी-OCT प्रणाली और निर्माण दिशानिर्देशों के विवरण का वर्णन करते हैं । 3 डी अक्टूबर डेटा से, एक 3 डी गाया और ओर्थोगोनल स्लाइस के साथ अंडाकार आकृति की समग्र संरचना कल्पना कर सकते हैं, आकार और मात्रा की रूपात्मक जानकारी के आधार पर ट्यूमर अंडाकार आकृति के अनुदैर्ध्य वृद्धि वक्र विशेषताएं, और के विकास की निगरानी मृत-ट्यूमर अंडाकार आकृति में सेल क्षेत्रों ऑप्टिकल आंतरिक क्षीणन कंट्रास्ट के आधार पर । हम बताते है कि एचटी-अक्टूबर एक उच्च प्रवाह के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है इमेजिंग दवा स्क्रीनिंग के लिए साधन के रूप में अच्छी तरह के रूप में निस्र्पक पूर्वनिर्मित नमूने ।

Introduction

कैंसर दुनिया में मौत का दूसरा प्रमुख कारण है1. कैंसर लक्ष्यीकरण दवाओं के विकास के रोगियों के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है । हालांकि, यह अनुमान है कि नए विरोधी कैंसर दवाओं की अधिक से अधिक ९०% विकास के चरण में विफल क्योंकि नैदानिक परीक्षण में प्रभावकारिता और अप्रत्याशित विषाक्तता की कमी2. कारण का हिस्सा यौगिक स्क्रीनिंग के लिए सरल दो आयामी (2d) सेल संस्कृति मॉडल के उपयोग के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है, जो दवा डिस्कवरी2 के निंनलिखित चरणों के लिए यौगिक प्रभावकारिता और विषाक्तता के सीमित पूर्वानुमानित मूल्यों के साथ परिणाम प्रदान , 3 , 4. हाल ही में, तीन आयामी (3 डी) ट्यूमर अंडाकार आकृति मॉडल विरोधी कैंसर दवा डिस्कवरी3,4,5 के लिए नैदानिक प्रासंगिक शारीरिक और औषधीय डेटा प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. चूंकि इन spheroids के ऊतकों में ट्यूमर के विशिष्ट गुणों की नकल कर सकते है vivo, जैसे पोषक तत्व और ऑक्सीजन ढाल, hypoxic कोर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दवा प्रतिरोध19, इन मॉडलों के उपयोग के संभावित रूप से कम कर सकते है दवा डिस्कवरी समयरेखा, निवेश की लागत को कम करने, और रोगियों को और अधिक प्रभावी ढंग से नई दवाएं ले आओ । 3 डी ट्यूमर अंडाकार आकृति विकास में यौगिक प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण9,26उपचार के तहत अंडाकार आकृति वृद्धि और पुनरावृत्ति की निगरानी करने के लिए है । ऐसा करने के लिए, मात्रात्मक characterizations ट्यूमर आकृति विज्ञान, इसके व्यास और मात्रा को शामिल, उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग मोडल के साथ, आवश्यक हैं ।

इस तरह के उज्ज्वल के रूप में पारंपरिक इमेजिंग रूपरेखा, क्षेत्र, चरण कंट्रास्ट7,9,22,24, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी8,9,16, 18,22 अंडाकार आकृति के व्यास का माप प्रदान कर सकते हैं, लेकिन 3 डी अंतरिक्ष में अंडाकार आकृति की समग्र संरचना को हल नहीं कर सकता । कई कारकों अंडाकार आकृति में जांच प्रकाश के प्रवेश सहित इन सीमाओं के लिए योगदान; अंडाकार आकृति में फ्लोरोसेंट रंगों का प्रसार; अंदर या मजबूत अवशोषण और तितर बितर करने के लिए कारण अंडाकार आकृति के विपरीत सतह पर उत्तेजित फ्लोरोसेंट रंजक से फ्लोरोसेंट संकेतों उत्सर्जित; और इन इमेजिंग मोडलों की गहराई-संपति । यह अक्सर एक गलत मात्रा माप की ओर जाता है । spheroids में गल कोर के विकास में vivo ट्यूमर6,10,15,19,25में परिगलन नकल करते हैं । इस रोग की सुविधा की संभावना नहीं 2d सेल संस्कृतियों19,25,27,28में reproduced है । व्यास में ५०० µm से बड़ा एक अंडाकार आकृति आकार के साथ, proliferating कोशिकाओं की बाहरी परत, quiescent कोशिकाओं की एक मध्यम परत, और एक गल कोर सहित एक तीन परत गाढ़ा संरचना, अंडाकार आकृति6,10 में मनाया जा सकता है ,15,19,25, ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की कमी के कारण । लाइव और डेड सेल प्रतिदीप्ति इमेजिंग, गल कोर की सीमा को लेबल करने के लिए मानक दृष्टिकोण है । हालांकि, फिर से, दोनों इन फ्लोरोसेंट रंजक और दृश्यमान प्रकाश के पेनेट्रेशन को अपने वास्तविक आकार में अपने विकास की निगरानी के लिए गल कोर में जांच करने की क्षमता में बाधा ।

एक वैकल्पिक 3 डी इमेजिंग रूपरेखा, ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (अक्टूबर) के लिए ट्यूमर spheroids विशेषताएं शुरू की है । अक्टूबर एक जैव चिकित्सा इमेजिंग तकनीक है कि लेबल से मुक्त, गैर विनाशकारी 3 डी डेटा प्राप्त करने में सक्षम है जैविक ऊतकों में 1-2 mm गहराई तक29,30,31,३२,३३ ,३४. OCT कम जुटना interferometry को रोजगार के नमूने के विभिंन गहराई से वापस बिखरे संकेतों का पता लगाने और दोनों पार्श्व और ऊर्ध्वाधर दिशाओं में माइक्रोन स्तर के स्थानिक प्रस्तावों पर गहराई से हल छवियों को खंगाला प्रदान करता है । OCT व्यापक रूप से नेत्र विज्ञान३५,३६,३७ और एंजियोग्राफी३८,३९में अपनाया गया है । पिछले अध्ययन में इन विट्रो ट्यूमर spheroids में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के आकृति विज्ञान का पालन करने के लिए OCT का उपयोग किया है (जैसे, Matrigel) और photodynamic थेरेपी के लिए उनकी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन४०,४१. हाल ही में, हमारे समूह एक उच्च प्रवाह OCT इमेजिंग मंच की स्थापना के लिए व्यवस्थित निगरानी और बहु में 3 डी ट्यूमर spheroids के विकास कैनेटीक्स मात्रा ठीक४२प्लेटें । 3 डी ट्यूमर spheroids का सटीक volumetric ठहराव आंतरिक ऑप्टिकल क्षीणन विपरीत पर आधारित spheroids में एक voxel गिनती दृष्टिकोण और लेबल-नि: शुल्क गल ऊतक का पता लगाने का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । यह कागज कैसे अक्टूबर इमेजिंग मंच का निर्माण किया गया था और उच्च संकल्प ट्यूमर spheroids के 3 डी छवियों को प्राप्त करने के लिए कार्यरत का ब्यौरा वर्णन करता है । अंडाकार आकृति व्यास और वॉल्यूंस की सटीक माप सहित 3डी ट्यूमर spheroids के ग्रोथ कैनेटीक्स के स्टेप-बाय-स्टेप मात्रात्मक विश्लेषणों का वर्णन किया गया है । इसके अलावा, गैर-विनाशकारी का पता लगाने की विधि अक्टूबर का उपयोग करते हुए ऊतक क्षेत्रों, आंतरिक ऑप्टिकल क्षीणन कंट्रास्ट के आधार पर प्रस्तुत किया गया है ।

Protocol

1. कोशिकाओं की तैयारी एक योग्य आपूर्तिकर्ता से सेल लाइनों प्राप्त करें ।नोट: सत्यापित करें कि कक्ष पंक्तियों से ब्याज की सेल संस्कृति मीडिया में या एक सब्सट्रेट (Matrigel की तरह तहखाने झिल्ली मैट्रिक्?…

Representative Results

एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट में Spheroids के उच्च प्रवाह ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी इमेजिंग चित्रा 3 2 दिन पर HCT ११६ ट्यूमर spheroids के साथ एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट की एचटी-OCT स?…

Discussion

ट्यूमर गतिविधि अपने रूपात्मक संरचना के लिए अत्यधिक प्रासंगिक है । 2d सेल संस्कृतियों के लिए विशेषता वृद्धि वक्र निगरानी के लिए इसी तरह, 3 डी ट्यूमर spheroids के लिए विकास वक्र ट्रैकिंग भी एक पारंपरिक दृष्टिको…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम NSF ग्रांट्स IDBR (DBI-१४५५६१३), PFI: एयर-टीटी (आईआईपी-१६४०७०७), NIH पलाश R21EY026380, R15EB019704 और R01EB025209, और Lehigh यूनिवर्सिटी स्टार्टअप फंड द्वारा सपोर्ट किया गया ।

Materials

Custom Spectral Domain OCT imaging system Developed in our lab
Superluminescent Diode (SLD) Thorlabs SLD1325 light source
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio AC Photonics WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Focusing Lens Thorlabs
Kinematic Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
1D Translational Stage Thorlabs
Continuous neutral density filter Thorlabs
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Sample Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Galvanometer Thorlabs
Relay Lens Thorlabs AC254-100-C two Relay lens to make a telescope setup
Triangle Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
Objective Mitutoyo
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Polarization Controller Thorlabs
30mm Cage Mount Thorlabs
Cage Rod Thorlabs
Stage
3D motorized translation stage Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. JTH360XY
2D Tilting Stage
Rotation Stage
Plate Holder 3D printed
Spectrometer
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Grating Wasatch G = 1145 lpmm
F-theta Lens Thorlabs FTH-1064-100
InGaAs Line-scan Camera Sensor Unlimited SU1024-LDH2
Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Component
HCT 116 Cell line ATCC CCL-247
Cell Culture Flask SPL Life Sciences 70025
Pipette Fisherbrand 14388100
Pipette tips Sorenson Bioscience 10340
Gibco GlutaMax DMEM Thermo Fisher Scientific 10569044
Fetal Bovine Serum, certified, US origin Thermo Fisher Scientific 16000044
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) Thermo Fisher Scientific 15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3120
Gloves VWR 89428-750
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Transfer pipets Globe Scientific 138080
Centrifuge Eppendorf 5702 R To centrifuge the 15 mL tube
Centrifuge NUAIRE AWEL CF 48-R To centrifuge the 96-well plate
Microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Histology & IHC
Digital slide scanner Leica Aperio AT2 Obtain high-resolution histological images
Histology Service Histowiz Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid
Name Company Catalog Number Comments
List of Commerical OCTs
SD-OCT system Thorlabs Telesto Series
SD-OCT system Wasatch Photonics WP OCT 1300 nm
Name Company Catalog Number Comments
Software for Data Analyses
Basic Image Analysis NIH ImageJ Fiji also works.
3D Rendering Thermo Fisher Scientific Amira Commercial software. Option 1
3D Rendering Bitplane Imaris Commercial software. Option 2. Used in the protocol
OCT acquisition software custom developed in C++.
Stage Control Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. MRC_3 Incorporated into the custom OCT acquisition code
OCT processing software custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code.
Morphological and Physiological Analysis custom developed in MATLAB

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References

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