इन विट्रो और में-सेल आकार छोटे अणु प्रेरित पूर्व mRNA संरचनात्मक परिवर्तन की जांच करने के लिए का उपयोग करना
Summary
दोनों इन विट्रो और में सेल चयनात्मक 2 ‘ के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल-हाइड्रॉक्सिल acylation प्राइमर विस्तार (आकार) प्रयोगों द्वारा विश्लेषण के लिए एक आरएनए-लक्ष्यीकरण छोटे अणु की उपस्थिति में ब्याज की पूर्व mRNA अनुक्रम के माध्यमिक संरचना निर्धारित करने के लिए कर रहे हैं इस लेख में प्रस्तुत किया ।
Abstract
छोटे अणुओं को लक्षित करने वाली आरएनए के औषध विकास की प्रक्रिया में, elucidating के साथ उनकी बातचीत पर संरचनात्मक परिवर्तन को लक्षित आरएनए अनुक्रम वांछित है । हम इस के साथ साथ इन विट्रो में एक विस्तृत प्रदान और सेल चयनात्मक 2 ‘-हाइड्रॉक्सिल acylation प्राइमर विस्तार द्वारा विश्लेषण (आकार) के लिए आरएनए रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष के लिए एक प्रयोगात्मक दवा की उपस्थिति में संरचनात्मक परिवर्तन का अध्ययन (SMA), की उत्तरजीविता मोटर न्यूरॉन (SMN)-C2, और SMN2 जीन के प्री-mRNA के एक्सॉन 7 में. इन विट्रो आकृति में, १४० न्यूक्लियोटाइड SMN2 एक्सॉन 7 युक्त एक आरएनए अनुक्रम T7 आरएनए पोलीमरेज़ द्वारा लिखित है, SMN-C2 की उपस्थिति में जोड़कर, और बाद में एक हल्के 2 द्वारा संशोधित ‘-ओह acylation रिएजेंट, 2-methylnicotinic एसिड imidazolide (NAI). यह 2 ‘-ओह-NAI adduct आगे एक ३२पी द्वारा जांच की है-प्राइमर विस्तार लेबल और polyacrylamide जेल ट्रो द्वारा हल (पृष्ठ) । इसके विपरीत, 2 ‘-ओह acylation में सेल आकार में रहने वाले कोशिकाओं में SMN-C2 बाउंड सेलुलर आरएनए के साथ सीटू में जगह लेता है. SMN2 जीन में एक्सॉन 7 के पूर्व mRNA अनुक्रम, प्राइमर विस्तार में आकार प्रेरित उत्परिवर्तनों के साथ, तो पीसीआर द्वारा परिलक्षित और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के अधीन था । दोनों के तरीके की तुलना में, इन विट्रो आकार एक अधिक लागत प्रभावी तरीका है और गणना के लिए परिणाम कल्पना शक्ति की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, इन विट्रो में आकार-प्राप्त आरएनए मॉडल कभी कभार एक सेलुलर संदर्भ में माध्यमिक संरचना से भटक, आरएनए-बंधन प्रोटीन के साथ सभी बातचीत के नुकसान की संभावना के कारण. में सेल आकार एक रेडियोधर्मी सामग्री कार्यस्थल की जरूरत नहीं है और सेलुलर संदर्भ में एक और अधिक सटीक आरएनए माध्यमिक संरचना पैदावार । इसके अलावा, सेल आकार में आम तौर पर अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग करके आरएनए अनुक्रम (~ १,००० न्यूक्लियोटाइड) की एक बड़ी रेंज के लिए लागू है, इन विट्रो आकार (~ २०० न्यूक्लियोटाइड) है कि आमतौर पर पृष्ठ विश्लेषण पर निर्भर करता है की तुलना में । SMN2 प्री-mRNA में 7 एक्सॉन के मामले में, इन विट्रो और सेल में आकार व्युत्पंन आरएनए मॉडल एक दूसरे के समान हैं ।
Introduction
चयनात्मक 2 ‘-हाइड्रॉक्सिल acylation प्राइमर विस्तार द्वारा विश्लेषण (आकार) ब्याज की एक आरएनए अनुक्रम में प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड के कैनेटीक्स को मापने की एक विधि है और एकल-elucidating संकल्प1पर माध्यमिक संरचना न्यूक्लियोटाइड । आकार के तरीके में, दोनों इन विट्रो स्थितियों में2,3,4 (एक परिभाषित बफर सिस्टम में शुद्ध आरएनए) और लिविंग स्तनधारी कोशिकाओं में5,6, माध्यमिक की जांच करने के लिए विकसित किया गया है मध्यम लंबाई शाही सेना के अनुक्रम की संरचना (आमतौर पर < इन-सेल आकार के लिए 1000 न्यूक्लियोटाइड और < इन विट्रो आकार के लिए 200 न्यूक्लियोटाइड) । यह विशेष रूप से आरएनए के लिए बाध्यकारी पर रिसेप्टर आरएनए में संरचनात्मक परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है-बातचीत छोटे अणु चयापचयों2,4,7,8 और यंत्रवत क्रियाओं का अध्ययन करने के लिए आरएनए-औषध विकास के दौरान अणुओं को लक्षित करने के9,10.
आरएनए-लक्ष्यीकरण ड्रग डिस्कवरी हाल ही में शैक्षिक प्रयोगशालाओं और दवा उद्योग में ध्यान खींचा है11,12 अलग दृष्टिकोण और रणनीतियों के माध्यम से13,14,15 ,16. आरएनए के हाल के उदाहरणों-नैदानिक उपयोग के लिए छोटे अणुओं लक्ष्यीकरण दो संरचनात्मक रूप से अलग प्रयोगात्मक दवाओं, LMI-०७०17 और आरजी-७९१६18,19, रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष (SMA) के लिए, जो होनहार दिखाया द्वितीय चरण नैदानिक परीक्षणों में परिणाम20. दोनों अणुओं मोटर ंयूरॉन (SMN) 2 पूर्व mRNA के अस्तित्व को लक्षित करने और SMN2 जीन6,17,21के ब्याह की प्रक्रिया को विनियमित करने के लिए प्रदर्शन किया गया । हम पहले इन विट्रो और में सेल आकार में लक्ष्य आरएनए की एक परीक्षा में संरचनात्मक परिवर्तन आरजी-७९१६ के रूप में जाना जाता SMN-C26के एक एनालॉग की उपस्थिति में प्रदर्शन किया ।
सिद्धांत रूप में, आकार 2 ‘-ओह acylation दर एक आरएनए अनुक्रम के प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड एक आत्म की अधिक मात्रा में एक निष्पक्ष तरीके से शमन acylation एजेंट की उपस्थिति में के उपाय । acylation एजेंट पानी में स्थिर नहीं है, के साथ एक छोटी आधा जीवन (जैसे, टी1/2 = 17 एस के लिए 1-मिथाइल-7-nitroisatoic एनहाइड्राइड; या 1M7, ~ 2 के लिए 20 मिनट-methylnicotinic एसिड imidazolide, या NAI)22 और संवेदनहीनता की पहचान के लिए ठिकाने23. यह 2 ‘ के एक अधिक अनुकूल acylation में परिणाम लचीले अड्डों के OH समूहों, जो प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड की गतिशीलता का एक सटीक आकलन में तब्दील किया जा सकता है । विशेष रूप से, एक आधार में एक न्यूक्लियोटाइड-जोड़ी आमतौर पर कम प्रतिक्रियाशील एक से एक 2 ‘-ओह संशोधित एजेंट, जैसे NAI और 1M7 है ।
आरएनए टेंपलेट के स्रोत को देखते हुए और जहां 2 ‘-ओह acylation जगह लेता है, आकार आम तौर पर इन विट्रो में वर्गीकृत किया जा सकता है और में सेल आकार । इन विट्रो आकार शुद्ध T7 लिखित आरएनए का उपयोग करता है और प्रयोगात्मक डिजाइन में एक सेलुलर संदर्भ का अभाव है । में सेल आकार, दोनों आरएनए टेंपलेट प्रतिलेखन और 2 ‘-ओह acylation जीवित कोशिकाओं के भीतर होते हैं; इसलिए, परिणाम एक सेलुलर संदर्भ में आरएनए संरचनात्मक मॉडल दोहराऊंगा कर सकते हैं । इन-सेल शेप में साहित्य24में लिविंग सेल में किए गए शेप के लिए वीवो शेप में भेजा गया है । चूंकि यह प्रयोग किसी जानवर में नहीं किया जाता है, इसलिए हमने इस प्रयोग को सटीकता के लिए इन-सेल आकार के रूप में माना है ।
इन विट्रो और इन-सेल शेप के प्राइमरी एक्सटेंशन स्टेज के लिए रणनीतियां भी अलग हैं । इन विट्रो में आकार, रिवर्स प्रतिलेखन 2 मिलीग्राम पर बंद हो जाता है ‘-ओह acylation की उपस्थिति में की स्थिति2 Mg +. एक ३२पी लेबल प्राइमर विस्तार इसलिए polyacrylamide जेल ट्रो (पृष्ठ) में एक बैंड के रूप में प्रकट होता है और बैंड की तीव्रता acylation दर1के लिए आनुपातिक है । में कक्ष आकार, रिवर्स प्रतिलेखन 2 में यादृच्छिक उत्परिवर्तनों उत्पंन ‘-2 Mn की उपस्थिति में ओह adduct स्थिति+। प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड के उत्परिवर्तन दर अगली पीढ़ी के अनुक्रमण गहराई में द्वारा कब्जा कर लिया जा सकता है, और एकल-न्यूक्लियोटाइड संकल्प पर आकार जेट फिर गणना की जा सकती है ।
में सेल आकार के लिए एक संभावित समस्या कम संकेत करने वाली शोर अनुपात है (यानी, 2 ‘ के बहुमत-OH समूह unmodified है, जबकि unmodified दृश्यों अगली पीढ़ी के अनुक्रमण में पढ़ने के सबसे कब्जा) । । हाल ही में, एक विधि 2 ‘ को समृद्ध-ओह संशोधित आरएनए, vivo क्लिक करें आकार (icSHAPE) के रूप में संदर्भित, चांग प्रयोगशाला25द्वारा विकसित किया गया था । यह संवर्धन पद्धति ऐसे आरएनए बातचीत के रूप में कमजोर छोटे अणुओं का अध्ययन करने में लाभप्रद हो सकता है, विशेष रूप से एक transcriptome व्यापक पूछताछ में ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इन विट्रो में आकार, यह उच्च गुणवत्ता सजातीय आरएनए टेम्पलेट का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । T7 प्रतिलेखन, हालांकि, अक्सर विषम अनुक्रम३६पैदावार । विशेष रूप से, 3 में ± 1 न्यूक्लियोटाइड के साथ अ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIH R01 ग्रांट (NS094721, K.A.J.) द्वारा संभव बनाया गया था ।
Materials
| DNA oligonucleotide | IDT | gBlock for > 200 bp DNA synthesis | |
| Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix | Thermo Fisher | F566S | |
| NucleoSpin gel and PCR clean-up kit | Takara | 740609.50 | |
| MegaScript T7 transcription kit | Thermo Fisher | AM1333 | Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase |
| DEPC-treated water | Thermo Fisher | 750023 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Thermo Fisher | LC6876 | |
| 40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Fisher | 15581044 | |
| Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34133 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| SYBR-Safe dye | Thermo Fisher | S33102 | |
| 6 % TBE-urea mini-gel | Thermo Fisher | EC6865BOX | |
| ChemiDoc | Bio-Rad | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| γ-32P-ATP | Perkin Elmer | NEG035C005MC | |
| Hyperscreen™ Intensifying Screen | GE Healthcare | RPN1669 | calcium tungstate phosphor screen |
| phosphor storage screen | Molecular Dynamics | BAS-IP MS 3543 E | |
| Amersham Typhoon | GE Healthcare | ||
| NAI (2M) | EMD Millipore | 03-310 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18090010 | Contains 5X RT buffer, SuperScript IV |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | |
| ddNTP set (5mM) | Sigma | GE27-2045-01 | |
| large filter paper | Whatman | 1001-917 | |
| Gel dryer | Hoefer | GD 2000 | |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Also contains RNase A and protease K |
| SMN2 minigene34 | Addgene | 72287 | |
| Heat inactivated FBS | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Pen-Strep | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher | 31985062 | |
| FuGene HD | Promega | E2311 | |
| TrpLE | Thermo Fisher | 12605010 | |
| DPBS without Ca/ Mg | Thermo Fisher | 14190250 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596018 | |
| RNeasy mini column | Qiagen | 74104 | Also contains RW1, RPE buffer |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Contains DNase I and RDD buffer |
| Deionized formamide | Thermo Fisher | AM9342 | |
| MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| random nonamer | Sigma-Aldrich | R7647 | |
| SuperScript First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 11904-018 | Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase |
| AccuPrime pfx DNA polymerse | Thermo Fisher | 12344024 | |
| NextSeq500 | Illumina | ||
| NucAway column | Thermo Fisher | AM10070 | for desalting purpose |
Referências
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