Usando em forma de Vitro e na célula para investigar a pequena molécula induzida por alterações estruturais Pre-mRNA
Summary
São protocolos detalhados para ambos in vitro e na célula seletiva 2′-hidroxila acilação analisados por experiências de extensão (forma) da primeira demão para determinar a estrutura secundária das sequências pre-mRNA de interesse na presença de uma pequena molécula de RNA-direcionamento apresentada neste artigo.
Abstract
No processo de desenvolvimento de drogas de RNA-direcionamento de pequenas moléculas, elucidar as mudanças estruturais em suas interações com sequências de RNA alvo é desejado. Aqui oferecemos uma detalhada em vitro e na célula seletiva 2′-hidroxila acilação analisados pela extensão da primeira demão protocolo (forma) para estudar a mudança estrutural de RNA na presença de uma droga experimental para a atrofia muscular espinhal (SMA), sobrevivência de motor neuron (SMN)-C2 e no exon 7 do pre-mRNA do gene SMN2. Em forma in vitro, uma sequência de RNA de 140 nucleotídeos contendo SMN2 exon 7 é transcrito por T7 RNA polimerase, dobrada na presença de SMN-C2 e posteriormente modificada por um reagente de acilação leve 2′-OH, imidazolide de ácido 2-methylnicotinic (NAI). Este aduto de 2′-OH-NAI é mais sondado por um 32extensão da primeira demão P-etiquetadas e resolvido por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Por outro lado, 2′-OH acilação em forma na célula ocorre in situ com RNA celular SMN-C2 vinculado em pilhas vivas. A sequência de pre-mRNA do exon 7 no gene SMN2, juntamente com mutações induzida por forma a extensão da primeira demão, então foi amplificada por PCR e sujeitos a próxima geração sequenciamento. Comparando as duas metodologias, forma in vitro é um método mais econômico e não exige poder computacional para visualizar os resultados. No entanto, o modelo de SHAPE-derivado de RNA in vitro às vezes difere da estrutura secundária em um contexto de celular, provavelmente devido à perda de todas as interações com proteínas RNA-obrigatórias. Na célula forma não precisa de um material radioativo no local de trabalho e produz uma estrutura secundária mais precisa de RNA no contexto celular. Além disso, a forma na célula é geralmente aplicável para uma maior sequências de gama de RNA (~ 1.000 nucleotídeos) utilizando o sequenciamento de próxima geração, em comparação com in vitro da forma (~ 200 nucleotídeos) que geralmente se baseia na análise de página. No caso do exon 7 em SMN2 pre-mRNA, a in vitro e na célula forma derivada modelos de RNA são semelhantes entre si.
Introduction
Seletiva 2′-hidroxila acilação analisada pela extensão da primeira demão (SHAPE) é um método de medir a cinética de cada nucleotídeo em uma sequência de RNA de interesse e elucidação da estrutura secundária em single-nucleotide resolução1. Metodologias de forma, tanto em condições in vitro2,3,4 (RNA purificado em um sistema de buffer definido) e em5,de células de mamíferos vivos6, foram desenvolvidos para investigar o secundário estrutura de sequências de comprimento médio do RNA (tipicamente < 1.000 nucleotídeos para a forma na célula e < 200 nucleotídeos para a forma in vitro). É particularmente útil para avaliar alterações estruturais no receptor RNA mediante ligação a RNA-interagindo pequena molécula metabolitos2,4,7,8 e estudar ações mecanicistas de moléculas de RNA-direcionamento durante o desenvolvimento de drogas9,10.
RNA-direcionamento de fármacos recentemente chamou a atenção nos laboratórios acadêmicos e a indústria farmacêutica11,12 através de diferentes abordagens e estratégias de14,13,15 ,16. Exemplos recentes de pequenas moléculas de RNA-direcionamento para uso clínico incluem duas drogas experimentais estruturalmente distintas, LMI-07017 e18,RG-791619, para a atrofia muscular espinhal (SMA), que mostrou-se promissora resultados na fase de ensaios clínicos II20. Ambas as moléculas foram demonstrou à sobrevivência de alvo de motor neuron (SMN) 2 pre-mRNA e regular o processo de emenda do SMN2 gene6,17,21. Temos demonstrado anteriormente a aplicação da in vitro e na célula forma um exame das mudanças estruturais na presença de um análogo de RG-7916 conhecido como SMN-C26alvo do RNA.
Em princípio, a forma mede a taxa de acilação de 2′-OH de cada nucleotídeo de uma sequência de RNA na presença de quantidades em excesso de um reagente de acilação Self têmpera de forma imparcial. O reagente de acilação não é estável em água, com uma meia-vida curta de (por exemplo, T1/2 = 17 s para anidrido de 1-metil-7-nitroisatoic; ou 1 M 7, ~ 20 min para imidazolide de ácido 2-methylnicotinic, ou NAI)22 e insensibilidade à identidade da as bases de23. Isso resulta em uma acilação mais favorável dos grupos de bases flexíveis, que podem ser transformados em uma avaliação correcta da dinâmica de cada nucleotídeo 2′-OH. Especificamente, um nucleotídeo em um par de base é geralmente menos reativo do que um não pareado com um reagente modificando 2′-OH, tais como NAI e 1 M 7.
Olhando para a fonte do modelo de RNA e onde ocorre a acilação de 2′-OH, forma geralmente pode ser categorizada em forma in vitro e na célula. Em usos de vitro forma purificada T7 transcrito de RNA e não possui um contexto celular em projetos experimentais. Em forma na célula, a transcrição de modelo de RNA e a acilação de 2′-OH ocorrerem dentro de células vivas; Portanto, os resultados podem recapitular o modelo estrutural de RNA em um contexto celular. Na célula forma tem sido referida como vivo de forma para forma transportada em células vivas, na literatura24. Desde que esta experiência não é executada em um animal, nós denominado esta experiência como forma na célula para a exatidão.
As estratégias para a fase de extensão da primeira demão de forma in vitro e na célula também são diferentes. Em forma in vitro, a transcrição reversa para na posição 2′-OH acilação, na presença de Mg2 +. Uma extensão da primeira demão de 32P-rotulados, portanto, aparece como uma banda em eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e a intensidade da banda é proporcional à taxa de acilação1. Em forma na célula, a transcrição reversa gera mutações aleatórias para o 2′-OH aduto posição na presença de Mn2 +. A taxa mutacional de cada nucleotídeo pode ser capturada no sequenciamento de próxima geração de profundidade, e a reatividade de forma em single-nucleotide resolução pode então ser calculada.
Um problema potencial para a forma na célula é a baixa relação sinal-ruído (isto é, a maioria dos grupos 2′-OH é inalterada, enquanto as sequências não modificadas ocupam a maioria da leitura na próxima geração sequenciamento). Recentemente, um método para enriquecer o 2′-OH modificado do RNA, referidos como vivo clique em forma (icSHAPE), foi desenvolvido pelo laboratório Chang25. Este método de enriquecimento pode ser vantajoso no estudo fracas moléculas pequenas tais como interações RNA, especialmente em um interrogatório de transcriptoma-largo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em forma in vitro, é fundamental usar modelo de RNA homogêneo de alta qualidade. Transcrição de T7, no entanto, muitas vezes produz sequências heterogêneas36. Especialmente, sequências com ± 1 nucleotídeo no 3′-terminal com rendimentos não negligenciável36 são geralmente difícil de ser removido pela purificação do gel de polyacrylamide. Modelo de RNA heterogêneo pode resultar em mais de um conjunto do sinal no gel de sequenciamento perfil do produto extensã…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi feito possível pela subvenção R01 NIH (NS094721, K.A.J.).
Materials
| DNA oligonucleotide | IDT | gBlock for > 200 bp DNA synthesis | |
| Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix | Thermo Fisher | F566S | |
| NucleoSpin gel and PCR clean-up kit | Takara | 740609.50 | |
| MegaScript T7 transcription kit | Thermo Fisher | AM1333 | Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase |
| DEPC-treated water | Thermo Fisher | 750023 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Thermo Fisher | LC6876 | |
| 40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Fisher | 15581044 | |
| Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34133 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| SYBR-Safe dye | Thermo Fisher | S33102 | |
| 6 % TBE-urea mini-gel | Thermo Fisher | EC6865BOX | |
| ChemiDoc | Bio-Rad | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| γ-32P-ATP | Perkin Elmer | NEG035C005MC | |
| Hyperscreen™ Intensifying Screen | GE Healthcare | RPN1669 | calcium tungstate phosphor screen |
| phosphor storage screen | Molecular Dynamics | BAS-IP MS 3543 E | |
| Amersham Typhoon | GE Healthcare | ||
| NAI (2M) | EMD Millipore | 03-310 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18090010 | Contains 5X RT buffer, SuperScript IV |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | |
| ddNTP set (5mM) | Sigma | GE27-2045-01 | |
| large filter paper | Whatman | 1001-917 | |
| Gel dryer | Hoefer | GD 2000 | |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Also contains RNase A and protease K |
| SMN2 minigene34 | Addgene | 72287 | |
| Heat inactivated FBS | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Pen-Strep | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher | 31985062 | |
| FuGene HD | Promega | E2311 | |
| TrpLE | Thermo Fisher | 12605010 | |
| DPBS without Ca/ Mg | Thermo Fisher | 14190250 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596018 | |
| RNeasy mini column | Qiagen | 74104 | Also contains RW1, RPE buffer |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Contains DNase I and RDD buffer |
| Deionized formamide | Thermo Fisher | AM9342 | |
| MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| random nonamer | Sigma-Aldrich | R7647 | |
| SuperScript First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 11904-018 | Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase |
| AccuPrime pfx DNA polymerse | Thermo Fisher | 12344024 | |
| NextSeq500 | Illumina | ||
| NucAway column | Thermo Fisher | AM10070 | for desalting purpose |
Referências
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