وجود خلية من خلايا U937 في غياب الطرد المركزي عالية السرعة
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لعزل غشاء البلازما والسيتوبلازم والميتوكوندريا U937 الخلايا دون استخدام الطرد المركزي عالية السرعة. يمكن استخدام هذا الأسلوب لتنقية الكسور سوبسيلولار لدراسة لاحقة للتعريب البروتين عن طريق إيمونوبلوتينج.
Abstract
في هذا البروتوكول أننا بالتفصيل طريقة الحصول على كسور سوبسيلولار U937 الخلايا دون استخدام تنبيذ فائق أو المنظفات عشوائية. ويستخدم هذا الأسلوب المخازن المؤقتة ناقص التوتر، ديجيتونين، وتحلل الميكانيكية والطرد المركزي التفاضلي لعزل السيتوبلازم، الميتوكوندريا وغشاء البلازما. العملية يمكن تحجيمها لاستيعاب احتياجات الباحثين، وهي غير مكلفة وبسيطة. سيسمح هذا الأسلوب الباحثين لتحديد التعريب البروتين في الخلايا دون المتخصصة أجهزة الطرد المركزي، ودون استخدام مجموعات تجارية، والتي يمكن أن تكون باهظة التكاليف. أننا استخدمت بنجاح هذا الأسلوب لفصل سيتوسوليك وغشاء البلازما والبروتينات المتقدرية في خط الخلية الوحيدات البشرية U937.
Introduction
الهوية موثوقة للتعريب البروتين ضروري غالباً عند دراسة مسارات الجزيئية في الخلايا حقيقية النواة. وتستخدم أساليب الحصول على كسور سوبسيلولار من الباحثين بدراسة المكونات الخلوية من اهتمام أوثق.
معظم أساليب تجزئة الخلية الحالية عموما تندرج في فئتين عريضتين، تستند إلى المنظفات1،2 و على أساس تنبيذ فائق3،4،5، التي يمكن أن تكون متباينة بالسرعة والدقة والتكلفة. المنظفات البروتوكولات استناداً إلى الاعتماد على استخدام المخازن المؤقتة مع زيادة قوة المنظفات جعل العناصر المتميزة للخلية. وهذا هو طريقة سريعة وملائمة لتجهيز العينات، ويمكن أن تكون فعالة من حيث التكلفة إذا كان عدد وحجم العينات الصغيرة. يمكن شراء مجموعات تستند إلى مواد التنظيف لعزل هيولى والغشاء/عضية (الكسر مختلطة) والكسور النووي من الخلايا. ومع ذلك، تحد عيوباً عديدة ترتبط بهذه المجموعات فائدتها للباحثين. تهدف إلى عزل عناصر واحد أو اثنين من الخلية بسهولة ولكنهم غير قادرين على عزل جميع الكسور من عينة في نفس الوقت. استخدام المنظفات يعني أن الغشاء البلازمية والعضيات محاطة الغشاء سوف سولوبيليزيد على قدم المساواة، ومن ثم غير قادر على يمكن فصلها عن بعضها البعض. مضاعفات إضافية تنشأ عن مكونات الملكية في هذه المجموعات مما يمنع الباحثين من تغيير الظروف لتطبيقات محددة. وأخيراً، أنها محدودة في عدد من الاستخدامات وقد يكون باهظ التكلفة لإجراء التجارب على نطاق أكبر. توجد مجموعات استناداً إلى عدم-المنظفات لعزل الميتوكوندريا، بيد أنها لم تصمم لعزل غشاء البلازما وعينه العائد إلى حد كبير أقل من كثافة استخدام الطرد المركزي القائمة على عزل البروتوكولات6،7 .
الأساليب التي تستخدم تنبيذ فائق للحصول على الكسور هي أكثر وقتاً طويلاً، لكن كثيرا ما تؤدي الكسور أنقى من مجموعات تستند إلى مواد التنظيف. لعزل الأغشية البلازمية من الخلايا دون سولوبيليزينج الأولى لهم (الذي ينتج عنه تلوث بغشاء العضيات) يتطلب منها أن يكون تفكيك بأسلوب غير المنظفات متبوعاً بالفصل بين المكونات الخلوية عبر التفاضلية الطرد المركزي – مع غشاء البلازما العزلة التي تتطلب سرعة 100,000 × ز لإنجاز. في كثير من الحالات، يجب أن يتبعها الطرد المركزي التفاضلي إيسوبيكنيك الكثافة المتدرجة الطرد المركزي لمزيد من الانفصال كسور الخلوية أو إزالة الملوثات. في حين أن هذه الأساليب شاملة وقابلة للتعديل، تشمل عيوب التكلفة واستهلاك الوقت، والحاجة أولتراسينتريفوجي للفصل بين الكسور وكذلك تنقية عبر الكثافة المتدرجة الطرد المركزي. على معظم أجهزة الطرد المركزي عالية السرعة بتكلفة باهظة للمحققين الفردية، وهي غالباً ما يشارك، الأساسية للمعدات في المؤسسات الأكاديمية. وهكذا، يصبح توافر ultracentrifuge الباهظة في هذه الحالات.
في هذا البروتوكول تجزئة نظهر عزلة الكسور سوبسيلولار دون استخدام المنظفات سولوبيليزينج ودون استخدام الطرد المركزي عالية السرعة. سيسمح هذا الأسلوب الباحثون عزل غشاء البلازما والميتوكوندريا ومكونات هيولى الخلية حقيقية النواة مع الحد الأدنى من التلوث بين الكسور.
Protocol
Representative Results
Discussion
وضع هذا البروتوكول قد نشأت من عدم قدرة على فصل mitochondrial وعينات الغشاء، باستخدام مجموعات المتاحة تجارياً، بتحليل للتعريب البروتين خلال نيكروبتوسيس14. القيود الأساسية لمجموعات premade هي قدرتها على أن تتكيف مع احتياجات الباحثين من الأفراد، التكلفة لكل عينة وعدد محدود من العينات قا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيده عمل المعاهد الوطنية للصحة-1R15HL135675-01 إلى تيموثي ج. لاروككا
Materials
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
Referências
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
- Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
- Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, a. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
- Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
- McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
- Simpson, R. J. Homogenization of Mammalian Tissue. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).
