En forbedret og høj overførselshastighed respiratorisk syncytialvirus (RSV) mikro-neutralisering Assay
Summary
Denne undersøgelse beskriver en høj produktivitet, imaging-baseret mikro-neutralisering assay til at bestemme titer af neutraliserende antistoffer specifikke for respiratorisk syncytialvirus (RSV). Dette assay format er blevet testet på forskellige prøve typer.
Abstract
Respiratorisk syncytial virus-specifikke neutraliserende antistoffer (RSV NAbs) er en vigtig markør for beskyttelse mod RSV. En række forskellige assay formater er i øjeblikket i brug over hele verden, så der er behov for en nøjagtig og høj overførselshastighed metode til måling af RSV Nimb. Vi beskriver her en imaging-baseret mikro-neutralisering assay, der er blevet testet på RSV undergruppe A og kan også tilpasses til RSV undergruppe B og forskellige prøve typer. Denne metode er meget reproducerbar, med Inter assay variationer for reference antiserum mindre end 10%. Vi mener, at denne analyse umiddelbart kan fastslås i mange laboratorier verden over til en relativt lav pris. Udvikling af en forbedret, høj overførselshastighed assay, der måler RSV NAbs repræsenterer et stort skridt fremad for standardisering af denne metode internationalt samt at være kritisk til evaluering af roman RSV vaccine kandidater i fremtiden.
Introduction
Respiratorisk syncytialvirus (RSV) er den hyppigste årsag til nedre luftvejsinfektioner i den pædiatriske befolkning på verdensplan1. Trods sin høje byrde findes der stadig ingen vaccine eller behandling. Siden 2013, har World Health Organization (WHO) erklæret RSV vaccine udvikling prioriteres større forskning med årlige WHO høring møder2,3. WHO har godkendt ved hjælp af RSV neutraliserende antistof (NAb) måling til at overvåge vaccine immunogenicitet, da dette er anerkendt som den store serologisk markør for beskyttelse4. Nimb har vist sig at beskytte mod alvorlige RSV infektion i en række undersøgelser samt kliniske forsøg med anti-RSV monoklonalt antistof palivizumab, i øjeblikket den kun forebyggende strategi tilgængelige4.
Der er flere NAb assay formater, der bruges af laboratorier verden over, herunder celle- og molekylært-baserede assays, der har gjort standardisering bestræbelser udfordrende5,6,7,8. Konventionelle plaque-reduktion neutralisering (PRN) analysen, der måler antallet af reducerede plak danner enheder (PFU) af en RSV-specifikke antistof er imidlertid stadig guldstandarden9. Her rapporterer vi en forbedret, forenklet og høj overførselshastighed PRN-protokol, der kan bruges på mange cellelinjer, for forskellige RSV stammer og med øget assay overførselshastighed. Denne protokol er blevet testet ved hjælp af kliniske prøver fra forskellige indstillinger samt på prøver fra dyremodel eksperimenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har udviklet og optimeret en enkel og effektiv RSV mikro-neutralisering assay, der let kan tilpasses de fleste laboratorier. Denne analyse er købedygtig opmåle virusinfektion evne samt måle hæmning af viral infektion af NAb på cellulært niveau ved hjælp af edb billedscanning. Brugen af en imaging-baseret platform og specifikke antistof-baserede systemer har øget specificitet og spot påvisningsfølsomhed sammenlignet med traditionelle plaque påvisning metoder6,<sup class="xr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke alle de involverede deltagere. Vi anerkender den victorianske regering operationelle infrastruktur Support Program. PVL er en NHMRC karriere udvikling Fellowship modtager.
Materials
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1X PBS for culture (stored at 4°C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22um (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5ml serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
Referências
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
- Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. . Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
