En forbedret og høy gjennomstrømning respiratorisk Syncytial Virus (RSV) mikro-nøytralisering analysen
Summary
Denne studien beskriver en høy gjennomstrømning, imaging-baserte mikro-nøytralisering analysen å bestemme titer av nøytraliserende antistoffer spesifikke for respiratorisk syncytial virus (RSV). Denne analysen format har blitt testet på ulike utvalg typer.
Abstract
Respiratory syncytial virus-spesifikke nøytraliserende antistoffer (RSV NAbs) er en viktig indikator for beskyttelse mot RSV. En rekke forskjellige analysen formater er i bruk over hele verden så er det behov for en nøyaktig og høy gjennomstrømming metode for å måle RSV NAbs. Her beskriver vi imaging-baserte mikro-nøytralisering analysen som er testet på RSV undergruppe A og kan også tilpasses for RSV undergruppe B og forskjellige utvalg. Denne metoden er svært reproduserbare, med Inter analysen varianter for referansen antiserum blir mindre enn 10%. Vi tror denne analysen kan lett bli etablert i mange laboratorier over hele verden til relativt lav kostnad. Utvikling av forbedret, høy gjennomstrømming analysen som måler RSV NAbs representerer et betydelig skritt fremover for standardisering av denne metoden internasjonalt samt å være kritisk for vurdering av romanen RSV vaksine kandidater i fremtiden.
Introduction
Respiratorisk syncytial virus (RSV) er den ledende årsaken til nedre luftveisinfeksjoner i pediatric befolkningen verden1. Til tross for sin høye byrden er det fortsatt ingen vaksine eller behandling tilgjengelig. Siden 2013, har World Health Organization (WHO) erklært RSV vaksineutvikling som en stor forskning prioritet, med årlige WHO samråd møter2,3. WHO har avtalt med RSV nøytralisere antistoff (NAb) måling overvåke vaksine immunogenisitet, som dette er anerkjent som den store serologisk markøren beskyttelse4. NAbs har vist seg å beskytte mot alvorlig RSV infeksjon i en rekke studier som kliniske studier av anti-RSV monoklonalt antistoff palivizumab, er det bare forebyggende strategi tilgjengelig4.
Det er flere NAb analysen formater som brukes av laboratorier over hele verden, inkludert celle- og molekylær-baserte analyser, som har gjort standardisering innsats utfordrende5,6,7,8. Konvensjonelle plakk-reduksjon nøytralisering (PRN) analysen som måler antallet redusert plakk danner enheter (PFU) av tilstedeværelsen av en RSV-spesifikke antistoffer er imidlertid fortsatt gullstandarden9. Her rapporterer vi en forbedret, forenklet og høy gjennomstrømming PRN-protokoll som kan brukes på flere linjer, for forskjellige RSV stammer og økte analysen gjennomstrømming. Denne protokollen er testet klinisk utvalg fra forskjellige innstillinger og prøver fra dyremodell eksperimenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har utviklet og optimalisert en enkel og effektiv RSV mikro-nøytralisering analysen som lett kan tilpasses i de fleste laboratorier. Denne analysen er kjøpedyktig mål virusinfeksjon evne samt måle hemming av viral infeksjon av NAb på cellenivå ved hjelp av datastyrt bildeskanning. Bruk av en imaging-basert plattform og spesifikke antistoffer-baserte systemer har økt spesifisitet og følsomhet av spot sammenlignet med tradisjonelle plakk gjenkjenning metoder6,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker alle deltakerne er involvert. Vi erkjenner den viktorianske regjeringen operative infrastruktur støtteprogrammet. PVL er en NHMRC karriere utvikling Fellowship-mottaker.
Materials
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1X PBS for culture (stored at 4°C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22um (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5ml serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
Referências
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
- Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. . Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
