Um ensaio de Microneutralização do vírus sincicial respiratório (VSR) melhorada e alta taxa de transferência
Summary
Este estudo descreve um alto throughput, com base em imagens de ensaio de microneutralização para determinar o título de anticorpos neutralizantes específicos para o vírus sincicial respiratório (VSR). Este formato de ensaio foi testado em tipos diferentes de amostra.
Abstract
Respiratórios sincicial vírus específicos anticorpos neutralizantes (RSV NAbs) são um importante marcador de proteção contra RSV. Um número de formatos diferentes de ensaio está atualmente em uso em todo o mundo para que haja a necessidade de um método de precisão e alta produtividade para medir RSV NAbs. Descrevemos aqui um ensaio de microneutralização com base em imagem que foi testado no subgrupo RSV A e também pode ser adaptado para o subgrupo RSV B e tipos de amostras diferentes. Este método é altamente reprodutível, com variações inter-ensaio para o soro de referência, sendo menos de 10%. Acreditamos que este ensaio pode ser prontamente estabelecido em muitos laboratórios em todo o mundo a um custo relativamente baixo. Desenvolvimento de um ensaio melhorado, elevado-throughput que mede RSV NAbs representa um significativo passo em frente para a padronização deste método internacionalmente, bem como sendo fundamental para a avaliação dos candidatos de vacina RSV romance no futuro.
Introduction
Vírus sincicial respiratório (VSR) é a principal causa de infecções do trato respiratório inferior na população pediátrica em todo o mundo1. Apesar de sua alta carga, não há ainda nenhuma vacina ou tratamento disponível. Desde 2013, a Organização Mundial de saúde (OMS) declarou-se desenvolvimento de vacina RSV como uma prioridade de pesquisa principais, com anual WHO consulta reuniões2,3. A OMS chegou a acordo sobre uso de RSV neutralizando a medição de anticorpo (NAb) para monitorar a imunogenicidade da vacina, como isto é reconhecido como o principal marcador serológico de proteção4. NAbs foram mostrados para proteger contra uma grave infecção pelo VSR em um número de estudos, bem como ensaios clínicos do palivizumab anti-VRS monoclonal anticorpo, atualmente a estratégia profilática apenas disponível4.
Existem vários formatos de ensaio NAb usados pelos laboratórios em todo o mundo, incluindo ensaios baseados em molecular e celular, que têm feito esforços de padronização desafiando5,6,7,8. No entanto, o ensaio de neutralização (PRN) placa convencional-redução que mede o número de placa reduzida, formando unidades (PFU) pela presença de um anticorpo específico RSV continua a ser o padrão-ouro9. Aqui, nós relatamos um protocolo PRN melhorado, simplificado e alta produtividade que pode ser usado em inúmeras linhas de célula, por diferentes cepas de RSV e com taxa de transferência maior do ensaio. Este protocolo foi testado usando amostras clínicas de diferentes configurações, bem como em amostras de experiências modelo animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Temos desenvolvido e aperfeiçoado um ensaio de microneutralização RSV simples e eficiente que pode ser facilmente adaptado na maioria dos laboratórios. Este ensaio é capaz de medir a capacidade de infecção viral, bem como a inibição da infecção viral por NAb a nível celular, usando a varredura de imagem computadorizada de medição. A utilização de uma plataforma baseada em imagem latente e sistemas baseados em anticorpos específicos aumentou a especificidade e a sensibilidade da deteção ponto comparada …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer todos os participantes envolvidos. Reconhecemos o programa de apoio de infra-estrutura operacional do governo vitoriano. LPC é um destinatário NHMRC Fellowship de desenvolvimento de carreira.
Materials
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1X PBS for culture (stored at 4°C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22um (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5ml serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
Referências
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
- Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. . Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
