Un test de Micro-neutralisation du Virus respiratoire Syncytial (VRS) amélioré et haut débit
Summary
Cette étude décrit un haut débit, essai micro-neutralisation d’imagerie afin de déterminer le titre des anticorps neutralisants spécifiques pour le virus respiratoire syncytial (VRS). Ce format de test a été testé sur les types d’échantillons différents.
Abstract
Respiratoires syncytiales virus spécifique des anticorps neutralisants (RSV NAbs) sont un marqueur important de protection contre la RSV. Un certain nombre de formats différents test est actuellement utilisées dans le monde y a donc un besoin d’une méthode précise et haut-débit pour mesurer la RSV NAbs. Nous décrivons ici une analyse micro-neutralisation axée sur l’imagerie qui a été testée sur le sous-groupe RSV A et peut également être adaptée pour la RSV sous-groupe B et types d’échantillons différents. Cette méthode est très reproductible, avec des variations entre dosages pour l’antisérum de référence est inférieur à 10 %. Nous croyons que ce dosage peut être facilement établi dans de nombreux laboratoires dans le monde entier à un coût relativement faible. Développement d’un test amélioré et à haut débit qui mesure RSV NAbs représente une avancée significative pour la normalisation de cette méthode au niveau international comme étant critiques pour l’évaluation des nouveaux vaccins RSV à l’avenir.
Introduction
Virus respiratoire syncytial (VRS) est la principale cause des infections des voies respiratoires basses dans la population pédiatrique dans le monde1. Malgré son poids élevé, il n’existe encore aucun vaccin ou traitement. Depuis 2013, l’organisation mondiale de la santé (OMS) a déclaré au point de vaccins RSV comme une priorité de recherche majeur, avec des réunions de la consultation de WHO annuel2,3. L’OMS a convenu sur l’utilisation de RSV neutralisant la mesure des anticorps (NAb) pour surveiller l’immunogénicité des vaccins, comme cela est reconnu comme le marqueur sérologique majeur de protection4. NAbs auraient dû être divulgués pour se protéger contre l’infection à VRS grave dans un certain nombre d’études ainsi que des essais cliniques de l’anticorps monoclonal anti-VRS palivizumab, actuellement la stratégie prophylactique uniquement disponible4.
Il existe plusieurs formats de dosage de NAb utilisées par les laboratoires dans le monde entier, y compris des analyses cellulaires et moléculaires, qui ont fait des efforts de normalisation difficile5,6,7,8. Cependant, le test de neutralisation (PRN) de plaque-réduction conventionnels qui mesure le nombre de plaque réduite formant des unités (PFU) par la présence d’un anticorps spécifique au RSV demeure l’ étalon-or9. Nous rapportons ici un protocole PRN amélioré, simplifié et haut débit qui peut être utilisé sur nombreuses lignées cellulaires, pour différentes souches de RSV et avec un débit accru de dosage. Ce protocole a été testé à l’aide d’échantillons cliniques de différents paramètres, ainsi que sur des échantillons provenant des expériences de modèle animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons développé et optimisé un test de micro-neutralisation de la RSV simple et efficace qui peut être facilement adapté à la plupart des laboratoires. Ce test est capable de mesurer la capacité d’infection virale ainsi que l’inhibition de l’infection virale par NAb au niveau cellulaire à l’aide de balayage d’image informatisée de mesure. L’utilisation d’une plateforme d’imagerie et systèmes de base d’anticorps spécifiques a augmenté la spécificité et la sensibilité de détection tac…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient tous les participants impliqués. Nous reconnaissons programme du gouvernement de Victoria de soutien opérationnel Infrastructure. PVL est une NHMRC carrière développement bourse bene.
Materials
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1X PBS for culture (stored at 4°C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22um (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5ml serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
Referências
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- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
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- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
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- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. . Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
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