Aqui, apresentamos um protocolo para monitorar a sobrevivência em uma única célula base e identificar variáveis que predizem significativamente a morte celular.
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Artigo de método
Monitoramento de sobrevivência Neuronal através de microscopia de fluorescência Longitudinal
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Ensaios de citotoxicidade padrão, que exigem a coleção de lisados ou células fixas em vários pontos de tempo, limitaram a sensibilidade e a capacidade para avaliar os fatores que influenciam o destino neuronal. Estes ensaios exigem a observação de populações isoladas de células em pontos de tempo discreto. Como resultado, as células individuais não podem ser seguidas prospectivamente ao longo do tempo, limitando severamente a capacidade de discriminar se subcellular eventos, tais como formação de partitura ou mislocalization de proteína, são drivers patogênicos da doença, respostas homeostáticas, ou mera coincidência fenômenos. Microscopia de célula única longitudinal supera estas limitações, permitindo que o pesquisador determinar diferenças na sobrevivência entre populações e desenhar relações causais com sensibilidade melhorada. Este guia de vídeo irá delinear um fluxo de trabalho representativo para experimentos de medição única célula sobrevivência de neurônios corticais preliminares rato, expressando uma proteína fluorescente. O espectador vai aprender a alcançar alta eficiência transfections, coletar e processar imagens, permitindo o acompanhamento prospectivo de células individuais e comparar a sobrevivência relativa das populações neuronais usando análise de riscos proporcionais de Cox.
Introdução
Morte celular anormal é um fator determinante em muitas doenças, incluindo câncer, neurodegeneração e derrame1. Ensaios de robustos e sensíveis para a morte celular são essenciais para a caracterização desses distúrbios, bem como o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para estender ou reduzir a sobrevivência celular. Atualmente existem dezenas de técnicas para medir a morte celular, diretamente ou através de de marcadores de substituto2. Por exemplo, morte celular pode ser avaliado visualmente com a ajuda de corantes vitais que mancham seletivamente células mortas ou vivas3, ou monitorando ....
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Protocolo
Animal vertebrado todo o trabalho foi aprovado pelo Comité sobre o uso e cuidado dos animais, da Universidade de Michigan (protocolo # PRO00007096). Experimentos são cuidadosamente planejados para minimizar o número de animais sacrificados. Grávida fêmea tipo selvagem (WT), ratos de longa Evans não-transgênicos (Rattus norvegicus) são alojados individualmente em câmaras equipadas com enriquecimento ambiental e cuidadas pela unidade de medicina Animal de laboratório (ULAM) da Universidade de Michigan, em acordo com o guia de NIH-suportado para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Todos os ratos foram mantidos em rotina de habitação para tão pouco tempo....
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Resultados
Usando o procedimento de transfeccao descrito aqui, DIV4 neurônios corticais de rato foram transfectados com um plasmídeo codificação da proteína fluorescente mApple. A partir do pós-transfection 24 h, células foram fotografadas por microscopia de fluorescência cada 24 h durante 10 dias consecutivos. As imagens resultantes foram organizadas conforme indicado na Figura 2, em seguida, costuradas, empilhadas e marcou para a morte celular (Fi.......
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Discussão
Aqui, é apresentada a metodologia para monitorar diretamente a sobrevivência neuronal em uma base de célula única. Em contraste com os tradicionais ensaios para a morte celular que são limitados a pontos de tempo discreto e populações inteiras de células, este método permite a avaliação contínua de uma variedade de fatores tais como a morfologia celular, expressão da proteína ou localização, e pode determinar como cada fator influencia a sobrevivência celular de forma prospectiva.
Esta metodol.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a Steve Finkbeiner e membros do laboratório Finkbeiner pelo pioneirismo microscopia robótica. Agradecemos também o Dan Peisach para a construção inicial do software necessário para o processamento de imagem e sobrevivência análise automatizada. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e Stroke (NINDS) R01-NS097542, Universidade de Michigan dobradura de proteína doença iniciativa e Ann Arbor ativo contra ALS.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Meio neurobasal | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Cloreto de magnésio hexahidratado | Sigma | M9272 | |
| Hidrato de ácido quinurênico | TCI | H0303 | |
| Poli D-lisina | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| Suplemento B27 | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicilina/Estreptomicina | GIBCO | 15140122 | |
| placas de 96 poços | TPP | 0876 |
Referências
- Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (20....
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Reimpressões e permissões
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