Identification des substrats de Kinase CK2 roman en utilisant une approche biochimique polyvalente
Summary
L’objectif de ce protocole est à étiqueter, enrichir et identifier les substrats de la protéine-kinase CK2 auprès d’un échantillon biologique complex tel qu’un lysat cellulaire ou l’homogénat tissulaire. Cette méthode s’appuie sur des aspects uniques de la CK2 biologie à cet effet.
Abstract
L’étude des relations de kinase-substrat est essentielle pour avoir une compréhension complète des fonctions de ces enzymes et leurs cibles en aval dans les États physiologiques et pathologiques. CK2 est une kinase de sérine/thréonine évolutivement conservés avec une liste croissante de centaines de substrats impliqués dans plusieurs processus cellulaires. En raison de ses propriétés pléiotropes, identifier et caractériser un ensemble complet de substrats CK2 a été particulièrement difficile et reste un obstacle à l’étude de cette enzyme importante. Pour relever ce défi, nous avons élaboré une stratégie expérimentale polyvalente qui permet l’enrichissement ciblée et identification des substrats de CK2 putatifs. Ce protocole tire parti de la spécificité unique double co-substrat de CK2 permettant thiophosphorylation spécifique de ses substrats dans une cellule ou un tissu lysat. Ces substrats protéiques sont ensuite alkylées, immunoprécipitée et identifié par liquide chromatography/tandem la spectrométrie de masse (LC-MS/MS). Nous avons déjà utilisé cette approche pour identifier avec succès des substrats CK2 de Drosophila ovaires et ici nous étendre l’application du présent protocole aux cellules de glioblastome humain, illustrant la capacité d’adaptation de cette méthode pour étudier la rôles biologiques de cette kinase dans divers organismes modèles et systèmes expérimentaux.
Introduction
Protéines kinases sont des éléments clés des cascades de transduction de signal. La phosphorylation des protéines substrat de ces enzymes suscite des réactions biologiques qui régissent les événements critiques contrôlant la division cellulaire, métabolisme et la différenciation, entre autres. CK2 est une exprimée de façon ubiquitaire, acidophiles sérine/thréonine kinase qui est conservé de la levure à l’homme et qui joue un rôle important dans de nombreux processus cellulaires, allant de la régulation transcriptionnelle de progression du cycle cellulaire à l’apoptose1 ,2,3. L’enzyme est un hétérotétramère composé de deux α catalytique (ou α’) sous-unités et deux de sous-unités β réglementaire4. En plus d’être hautement pléiotrope, CK2 présente deux autres caractéristiques inhabituelles qui compliquent l’analyse, à savoir l’activité constitutive5 et co-substrat double spécificité6. Cette dernière propriété CK2, dote de la capacité d’utiliser GTP comme ATP pour la phosphorylation de protéines substrats.
Délétion génétique des sous-unités catalytiques ou réglementaires de CK2 chez la souris entraîne la létalité embryonnaire indiquant qu’elle joue un rôle crucial lors du développement et de l’organogénèse7,8. CK2 est également surexprimé dans plusieurs types de cancer et représente donc un prometteur cible thérapeutique9,10,11. En effet, des inhibiteurs spécifiques cette activité cible de la kinase CK2 sont actuellement sous enquête pour ce but12,13,14. Alors que l’inhibition de la CK2 est une option viable, étant donnée sa nature pléiotropique, alternative et peut-être une approche plus rationnelle consisterait à cibler des substrats CK2 critiques qui sous-tendent la progression de certains cancers. Par conséquent, l’identification complète et la caractérisation de protéines substrats CK2 serait un bénéfice notable pour élucider l’ou les fonctions spécifique de cette kinase dans un type particulier de tissu ou une tumeur.
Nous décrivons ici une méthode biochimique polyvalente pour l’identification des substrats CK2 auprès d’un échantillon biologique complex comme une cellule ou un tissu lysat. Ce protocole tire parti de la spécificité du double co-substrat de CK2 par utilisation de l’analogue de GTP GTPγS (guanosine 5′-[γ-thio]triphosphate) qui ne peuvent pas utiliser les autres kinases endogènes. Cela permet effectivement de la kinase à « étiqueter » ses substrats au sein de cet échantillon subséquentes d’isolement et d’identification.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici une méthode relativement simple et biochimique pour l’identification des substrats de la protéine-kinase CK2 auprès d’un échantillon biologique complex. Les étapes critiques du présent protocole sont basées sur les propriétés enzymatiques inhabituelles de CK2 et comprennent thiophosphorylation CK2 dépendant des protéines substrat spécifique à l’aide de GTPγS et leurs immunoprécipitation ultérieure et identification. Avec ces résultats, nous avons démontré l’utilité…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de valorisation de recherche universelle du Commonwealth depuis le ministère de la santé de Pennsylvanie à sit
Materials
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
Referências
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