Pretargeted радиоиммунотерапия, основанный на реакции Дильса Альдера спроса обратной электрона

Summary

Этот протокол описывает синтеза и характеристика транс– cyclooctene (TCO)-изменение антитела и ¹⁷⁷Лу меченых тетразина (Tz) лиганд для pretargeted радиоиммунотерапия (ГПРЗ). Кроме того он подробно использование этих двух конструкций в vivo накопление и продольных терапия исследований в мышиных модели развития колоректального рака.

Abstract

В то время как радиоиммунотерапия (RIT) представляет собой перспективный подход для лечения рака, долго фармакокинетические half-life radiolabeled антител может привести к высокие дозы излучения на здоровые ткани. Возможно не удивительно, несколько различные стратегии были разработаны чтобы обойти это ограничение тревожным. Одним из наиболее перспективных подходов является pretargeted радиоиммунотерапия (ГПРЗ). ГПРЗ основывается на развязки радионуклидов от иммуноглобулинов, инъекционных их отдельно и затем позволяет им сочетать в естественных условиях в ткани-мишени. Этот подход использует исключительные свойства Ориентация опухоли антител плинтуса их фармакокинетические недостатки, тем самым снижение дозы облучения непромысловых тканей и облегчения использования радионуклидов с периодом полураспада, которые считается слишком коротким для использования в традиционной radioimmunoconjugates. За последние пять лет наша лаборатория и другие разработали подход к в vivo pretargeting, основанный на реакции Дильса-Альдера (IEDDA) обратная электрон спроса между транс– cyclooctene (TCO) и тетразина (Tz). Эта стратегия успешно применяется для pretargeted позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) и Однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ) изображений с различных систем антител антигена. В пару последних публикаций мы продемонстрировали эффективность на основе IEDDA ГПРЗ в мышиных моделях протоковой аденокарциномы поджелудочной железы и рака толстой кишки. В этом протоколе, мы описываем протоколы для использования Lu-DOTA-меченых тетразина лиганд ¹⁷⁷ГПРЗ ([¹⁷⁷Лу] Лу-DOTA-PEG₇– Tz) и TCO-модифицированные вариант колоректального рака, ориентация huA33 антител (huA33-TCO). Говоря более конкретно, мы будем описывать строительство huA33-ТКО, синтеза и radiolabeling [¹⁷⁷Лу] Лу-DOTA-PEG₇– Tz и производительность в vivo накопление и продольных терапия исследований в мышиных моделях колоректального рака.

Introduction

Радиоиммунотерапия (RIT) — использование антител для доставки терапевтических радионуклидов опухоли — уже давно заманчивые подход к лечению рака^1,2. Действительно, это обещание было подчеркнуто Соединенных Штатов еда и администрация снадобья утверждение двух radioimmunoconjugates для лечения неходжкинская лимфома: ⁹⁰Y-ibritumomab tiuxetan и ¹³¹-Тозитумомаб^{3 , 4}. пока даже с первых дней своего существования, клинические перспективы RIT сдерживаются критического осложнение: высоких радиационных доз до здоровых тканей^5,6. Вообще говоря, radioimmunoconjugates для RIT помечены долгоживущих радионуклидов (например, ¹³¹я [t_½ = 8.0 дней] и ⁹⁰Y [t_½ = 2,7 дней]) с физическим полураспада, которые согласуются также с долго фармакокинетические полураспада иммуноглобулинов. Это важно, поскольку это гарантирует, что это достаточно радиоактивности остается после антитела достиг своей оптимальной накопление после нескольких дней циркуляции. Однако эта комбинация длительного проживания раз в крови и долгосрочной физической полураспада неизбежно приводит к облучения здоровых тканей, тем самым снижения терапевтические отношения и ограничения эффективности терапии⁷. Были изучены несколько стратегий для обхода этой проблемы, включая использование усеченного антитела фрагментов таких Fab, Fab’, F(ab’)₂, minibodies и nanobodies^8,9,10. Один из самых перспективных и увлекательный, но несомненно комплекс, альтернативные подходы — в естественных условиях pretargeting¹¹.

В естественных условиях pretargeting является подход к ядерной изображений и терапии, которая стремится использовать изысканный аффинити и избирательности антител при плинтуса их фармакокинетические недостатки по^11,12,13. С этой целью radiolabeled антитела, используемые в традиционных радиоиммунотерапия деконструкции на две составляющие: лиганд малые молекулы и immunoconjugate, который можно привязать как опухолевого антигена и вышеупомянутые лиганд. Immunoconjugate вводят сначала и учитывая «старт», часто несколько дней, в течение которых он накапливается в ткани-мишени и очищает от крови. Впоследствии малые молекулы лиганд администрируется и сочетает в себе immunoconjugate на опухоль или быстро очищает от тела. По сути в естественных условиях pretargeting полагается на выполнение радиохимии в пределах самого тела. Путем уменьшения распространения радиоактивности, этот подход одновременно снижает дозы облучения до здоровых тканей и облегчает использование радионуклидов (например, ⁶⁸Ga,_½ t = 68 мин²¹¹; Как,_½ t = 7.2 h) с периодом полураспада, которые обычно считаются несовместимыми с векторов на основе антител.

Начиная с конца 80-х годов, были разработаны несколько различных подходов к в vivo pretargeting, включая стратегии, основанные на bispecific антител, взаимодействие между стрептавидина и биотин и гибридизации дополнительных олигонуклеотиды^{14,,1516,17,18}. Тем не менее каждый прошла обратно в различной степени осложнений, наиболее лихо сильнодействующих иммуногенность стрептавидина модифицированные антитела^19,20. За последние пять лет наша группа и другие разработали подход к в vivo pretargeting на основе быстрого и bioorthogonal обратная электрон спроса Дильса-Альдера перевязка между транс– cyclooctene (TCO) и тетразина (Tz) ^21,,2223,24. Самым успешным из этих стратегий использовали TCO-модифицированные антитела и Tz подшипник лиганд, как TCO обычно более стабильной в естественных условиях чем ее Tz партнера (рис. 1)^25,26. Как и другие pretargeting методики МАБ TCO immunoconjugate осуществляется впервые и дано время, чтобы очистить от обращения и накапливаются в опухолевой ткани. Впоследствии малые молекулы Tz лиганд вводят, после чего он либо клики с immunoconjugate в ткани-мишени или быстро очищает от тела. Это в vivo pretargeting стратегия оказался весьма эффективным для ПЭТ и ОФЭКТ изображений с несколькими системами различных антитела/antigen, последовательно производит изображения с высоким контрастом и позволяет использовать короткоживущих радионуклидов, такие как ¹⁸ F (t_½ = 109 мин) и ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12,7 h)^21,22,24. Совсем недавно была продемонстрирована эффективность на основе нажмите pretargeted радиоиммунотерапия (ГПРЗ) в мышиных моделях протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC) и колоректальные карциномы^27,28. С этой целью, терапевтические радионуклидов ¹⁷⁷Лу (β_Макс = 498 кэВ, т_1/2 = 6,7 дней) работал в сочетании с двух различных антител: 5B1, которая ориентирована на углеводный антиген 19.9 (CA19.9) повсеместно выражена в PDAC , и huA33, которое пристреливает A33, трансмембранный гликопротеин выражается в > 95% случаев колоректального рака. В обоих случаях такой подход к ¹⁷⁷Лу-ГПРЗ принесли концентрации высокой активности в опухолевой ткани, создали терапевтический эффект зависит от дозы и одновременно снижение концентрации деятельности в здоровых тканях, по сравнению с традиционными непосредственно под названием radioimmunoconjugates.

В этой статье мы опишем протоколы для использования Lu-DOTA-меченых тетразина лиганд ¹⁷⁷ГПРЗ ([¹⁷⁷Лу] Лу-DOTA-PEG₇– Tz) и TCO-модифицированные вариант huA33 антител (huA33-TCO). Говоря более конкретно, мы описываем строительство huA33-TCO (рис. 2), синтез и radiolabeling [¹⁷⁷Лу] Лу-DOTA-PEG₇– Tz (рис. 3 и рис. 4) и производительность в vivo накопление и исследования продольной терапии в мышиных моделях колоректального рака. Кроме того представитель результаты и обсуждения, мы представим образец набора данных, адрес возможных стратегий для оптимизации этого подхода и рассматривать эту стратегию в более широком контексте в vivo pretargeting и ГПРЗ. Наконец, важно отметить, что хотя мы решили сосредоточиться на pretargeting с помощью huA33-TCO и [¹⁷⁷Лу] Лу-DOTA-PEG₇– Tz в настоящем Протоколе, эта стратегия является весьма модульной и могут быть адаптированы с учетом широкий спектр антител и радионуклидов.

Protocol

Все в vivo животных экспериментов описанных в этой работе были выполнены согласно утвержденных протоколов и казнены под этические принципы и Мемориал Слоун Kettering Рак центр, Weill Cornell медицинский центр, Хантер колледж Институционального ухода за животными и использования комитетов (IAC…

Representative Results

Спряжение TCO для huA33 основывается на сцепное устройство между Амин реактивной TCO-NHS и остатков лизина на поверхности иммуноглобулина. Этот метод является весьма надежной и воспроизводимость и надежно дает степени из маркировки 2-4 TCO/МАБ. В этом случае MALDI-ToF масс-спектром…

Discussion

Одним из преимуществ этого подхода в vivo pretargeting — особенно в отношении стратегии основывается на bispecific антител и radiolabeled гаптенами — это ее модульность: транс– cyclooctene постановление может быть присоединен к любой антитела, и тетразина radioligands можно radiolabeled с чрезвычайным разнообр…

Materials

(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS)	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS)	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN)	Fisher Scientific	A998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc)	Fisher Scientific	A639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol)	Sigma-Aldrich	70023	Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM)	Fisher Scientific	D143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Fisher Scientific	D12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit	Fisher Scientific	UFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns	Fisher Scientific	45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous	Fisher Scientific	AC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	70-011-044	10x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTA	Macrocyclics	B-205	Store at -20 °C
Triethylamine (TEA)	Fisher Scientific	AC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA)	Fisher Scientific	A116-50
Tumor measuring device	Peira TM900	Peira TM900