基于逆电子需求函数-alder 反应的隐形放射免疫治疗
Summary
该协议描述了反式环磷 (tco) 修饰抗体和177个lu-tazine (tz) 辐射寡核苷酸的合成和表征, 用于预定目标放射治疗 (prit)。此外, 它还详细介绍了这两种结构在结直肠癌小鼠模型中的应用, 用于体内生物分布和纵向治疗研究。
Abstract
虽然放射免疫治疗 (rit) 是治疗癌症的一种有前途的方法, 但放射性标记抗体的长的药代动力学半衰期可能导致对健康组织的高辐射剂量。也许并不奇怪, 已经制定了几种不同的策略来规避这一令人不安的限制。其中最有希望的方法之一是预定目标放射免疫治疗 (prit)。prit 的前提是将放射性核素与免疫球蛋白脱钩, 分别注射, 然后允许它们在目标组织的体内结合。这种方法利用抗体的特殊肿瘤靶向特性, 同时规避其药代动力学缺陷, 从而降低对非目标组织的辐射剂量, 并促进使用半衰期为被认为太短, 可用于传统的辐射免疫共轭物。在过去的五年里, 我们的实验室和其他实验室开发了一种基于反式环环素 (tco) 和四氮素 (tz) 之间的逆随需电-diels-alder (iedda) 反应的体内预瞄准方法。该策略已成功地应用于具有多种抗体抗原系统的预定目标正电子发射断层扫描 (pet) 和单光子发射计算机断层扫描 (spect) 成像。在最近的两篇文章中, 我们已经证明了基于 iedda 的 prit 在胰腺导管腺癌和结直肠癌的小鼠模型中的有效性。在本协议中, 我们描述了使用 177lu-dota 标记的四氨酸半径和 ([177路] ludat-peg 7-tz) 和针对 hua33 抗体 (hua-tco) 的结直肠癌 tco 修饰变种的 prit 协议.更具体地说, 我们将描述 hua33-tco 的结构, [177lu] lu-dota-pg7-z 的合成和放射状标记, 以及在小鼠模型中的体内生物分布和纵向治疗研究的性能。肠癌。
Introduction
放射免疫治疗 (rit)–使用抗体将治疗性放射性核素输送到肿瘤–长期以来一直是治疗癌症1,2的一种诱人方法。事实上, 美国食品药品监督管理局批准了治疗非霍奇金淋巴瘤的两种放射免疫共轭物: 90Y-ibritumomab tiuxetan 和131i-to质他莫单 3.,4. 然而, 即使从一开始, rit 的临床前景也受到一个严重并发症的阻碍: 对健康组织的高辐射剂量率5、6.一般来说, rit 的放射免疫共轭标记为长寿命放射性核素 (例如, 131i [t半= 8.0] 和90y [t–学期 = 2.7天]), 物理半衰期与免疫球蛋白的半衰期长。这一点至关重要, 因为它确保一旦抗体在循环几天后达到最佳生物分布, 就会保持足够的放射性。然而, 这种在血液中停留时间长和物理半衰期长的组合不可避免地导致健康组织的照射, 从而降低治疗率,限制治疗7的疗效。已经探索了几种策略来规避这个问题, 包括使用截断的抗体片段, 如 fab、fab ‘、f (ab‘)2、微型体和纳米棒8, 9,10。最有希望的、最引人入胜的、但不可否认的复杂的替代方法之一是在体内预先针对11。
在体内预定位是一种方法, 核成像和治疗, 寻求利用微妙的亲和力和选择性的抗体, 同时绕过其药代动力学的缺点 11,12,13。为此, 传统放射免疫治疗中使用的放射性标记抗体被解构为两个组成部分: 一个是小分子的放射性寡核苷酸, 另一个是免疫结合, 既能结合肿瘤抗原, 又能结合上述放射性寡聚 and。免疫共轭首先注射, 并给予 “头部启动”, 通常几天, 在此期间, 它积累在目标组织中, 并清除血液。随后, 小分子的放射寡核苷酸给药, 或者与肿瘤的免疫共轭结合, 或者迅速清除身体。从本质上讲,在体内, 预瞄准依赖于在体内进行放射性化学。通过减少放射性循环, 这种方法同时减少了对健康组织的辐射剂量, 并促进了放射性核素的使用 (例如, 68ga, t半= 68min211;由于半衰期通常被认为与基于抗体的向量不兼容, 因为 t 半 = 7.2 h)。
从20世纪80年代末开始, 开发了几种不同的体内预定位方法, 包括基于双特异性抗体的策略、链霉素与生物素的相互作用以及互补的杂交寡核苷酸14,15,16,17,18。然而, 每一种都被并发症不同程度地牵制住了, 最著名的是链霉素修饰抗体的强效免疫原性 19,20。在过去的五年里, 我们的团队和其他人已经开发出一种基于快速和生物正交逆电子需求 diels-alder 结扎的体内预定位方法。21,22,23,24。这些策略中最成功的是使用了 tco 修饰抗体和含 z 半径, 因为总体拥有成本通常比 tz 伙伴 (图 1)25、26更稳定. 与其他预靶向方法一样, mAb-TCO 免疫共轭首先被给予, 并给予时间从循环中清除并积累在肿瘤组织中。随后, 小分子 tz 半径低聚糖被注射, 之后它点击与免疫共轭在目标组织内或迅速地从身体清除。这种体内预瞄准策略已被证明是非常有效的 pet 和 spect 成像与几种不同的抗体抗原系统, 不断产生高对比度的图像, 并能够使用短命放射性核素, 如18f (t半= 109分钟) 和64铜 (t半= 12.7 小时)21,22,24。最近, 点击靶向放射免疫治疗 (prit) 的有效性已在胰导管腺癌 (pdac) 和结直肠癌 27,28的小鼠模型中得到了证明。为此, 结合两种不同的抗体使用了治疗性放射性核素177lu (β最大值 = 498 kev, t 半 = 6.7天): 5b1, 针对碳水化合物抗原 19.9 (c.9) 在 pdac 中普遍表示 和 hua33, 它的目标是 a33, 一种跨膜糖蛋白, 表达于 & gt;95 的结直肠癌。在这两种情况下, 这种方法对177luprit 在肿瘤组织中产生了较高的活性浓度, 产生了剂量依赖性的治疗效果, 与传统相比, 健康组织中的活性浓度降低。直接标记的辐射免疫共轭。
在本文中, 我们描述了使用177lu-dota 标记的四氨酸半径和 ([177 路] ludat-peg 7-tz) 和 hua33抗体 (hua33-tco) 的 tco 修饰变种的 prit 协议。更具体地说, 我们描述了 hua33-tco 的构造 (图 2)、[177lu] ludat-peg 7-tz 的合成和径向标记 (图 3和图 4), 以及在体内的性能。大肠癌小鼠模型的生物分布和纵向治疗研究。此外, 在具有代表性的结果和讨论中, 我们提出了一个样本数据集, 讨论了优化这种方法的可能策略, 并在体内预定位和 prit 的更广泛背景下考虑了这一策略。最后, 需要注意的是, 虽然我们选择在本协议中专注于使用 hua33-tco 和 [177lu] ludat-peg 7-tz进行预瞄准, 但这一策略是高度模块化的, 可以适应广泛的抗体和放射性 核素。
Protocol
Representative Results
Discussion
这种方法在体内预瞄准的优点之一–特别是在基于双特异性抗体和放射性标记的浸渍的策略方面–是它的模块化:反周期细胞分子可以附加到任何抗体上,四氮体辐射寡核苷酸可以用非常多的放射性核素进行放射性标记, 而不会损害它们与点击伙伴发生反应的能力。然而, 这种方法对其他抗体抗原系统的适应并不像复制这里描述的协议那么简单。当然, 任何试图创建一个新的 mAb-TCO 免疫共?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢雅各布·霍顿博士的有益对话。作者还要感谢国家卫生研究院的慷慨资助 (r00ca178205 和 U01CA221046)。
Materials
| (E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) | Sigma-Aldrich | 764523 | Store at -80 °C |
| 2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) | Sigma-Aldrich | 764701 | Store at -80 °C |
| Acetonitrile (MeCN) | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Ammonium Acetate (NH4OAc) | Fisher Scientific | A639-500 | |
| Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 70023 | Store at -20 °C |
| Dichloromethane (DCM) | Fisher Scientific | D143-1 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous | Fisher Scientific | D12345 | |
| EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | Fisher Scientific | UFC205024 | |
| GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous | Fisher Scientific | AC610941000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 70-011-044 | 10x Concentrated |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -20 °C |
| Triethylamine (TEA) | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | A116-50 | |
| Tumor measuring device | Peira TM900 | Peira TM900 |
Referências
- Goldenberg, D. M. Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies. Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).
- Goldenberg, D. M., et al. Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Antibody. Journal of Clinical Oncology. 9 (4), 548-564 (1991).
- Kaminski, M. S., et al. Radioimmunotherapy with 131I-Tositumomab for Relapsed or Refractory B-cell non-Hodgkin Lymphoma: Updated Results and Long-Term Follow-Up of the University of Michigan Experience. Blood. 96 (4), 1259-1266 (2000).
- Davies, A. J. Radioimmunotherapy for B-cell Lymphoma: Y90 Ibritumomab Tiuxetan and I131 Tositumomab. Oncogene. 26, 3614 (2007).
- Rajendran, J., et al. Comparison of Radiation Dose Estimation for Myeloablative Radioimmunotherapy for Relapsed or Recurrent Mantle Cell Lymphoma Using 131I Tositumomab to That of Other Types of Non-Hodgkin’s Lymphoma. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 19 (6), 738-745 (2004).
- Rajendran, J. G., et al. High-Dose 131I-Tositumomab (Anti-CD20) Radioimmunotherapy for Non-Hodgkin’s Lymphoma: Adjusting Radiation Absorbed Dose to Actual Organ Volumes. Journal of Nuclear Medicine. 45 (6), 1059-1064 (2004).
- Larson, S. M., Carrasquillo, J. A., Cheung, N. -. K. V., Press, O. Radioimmunotherapy of Human tumours. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 347-360 (2015).
- Kelly, M. P., et al. Tumor Targeting by a Multivalent Single-Chain Fv (scFv) Anti-Lewis Y Antibody Construct. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 23 (4), 411-423 (2008).
- Yazaki, P. J., et al. Tumor Targeting of Radiometal Labeled Anti-CEA Recombinant T84.66 Diabody and T84.66 Minibody: Comparison to Radioiodinated Fragments. Bioconjugate Chemistry. 12 (2), 220-228 (2001).
- van Duijnhoven, S. M. J., et al. Diabody Pretargeting with Click Chemistry In Vivo. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1422-1428 (2015).
- Altai, M., Membreno, R., Cook, B., Tolmachev, V., Zeglis, B. M. Pretargeted Imaging and Therapy. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1553-1559 (2017).
- Goldenberg, D. M., Chatal, J. -. F., Barbet, J., Boerman, O., Sharkey, R. M. Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting. Update on cancer therapeutics. 2 (1), 19-31 (2007).
- Rossin, R., et al. In-Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angewandte Chemie International Edition. 49 (19), 3375-3378 (2010).
- Gestin, J. F., et al. Two-Step Targeting of Xenografted Colon Carcinoma Using a Bispecific Antibody and 188Re-Labeled Bivalent Hapten: Biodistribution and Dosimetry Studies. Journal of Nuclear Medicine. 42 (1), 146-153 (2001).
- Green, D. J., et al. Comparative Analysis of Bispecific Antibody and Streptavidin-Targeted Radioimmunotherapy for B-cell Cancers. Pesquisa do Câncer. 76 (22), 6669 (2016).
- Sharkey, R. M., et al. Development of a Streptavidin−Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody, Radiolabeled Biotin Pretargeting Method for Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer. Studies in a Human Colon Cancer Xenograft Model. Bioconjugate Chemistry. 8 (4), 595-604 (1997).
- Knox, S. J., et al. Phase II Trial of Yttrium-90-DOTA-Biotin Pretargeted by NR-LU-10 Antibody/Streptavidin in Patients with Metastatic Colon Cancer. Clinical Cancer Research. 6 (2), 406 (2000).
- Schubert, M., et al. Novel Tumor Pretargeting System Based on Complementary L-Configured Oligonucleotides. Bioconjugate Chemistry. 28 (4), 1176-1188 (2017).
- Forero, A., et al. Phase 1 Trial of a Novel Anti-CD20 Fusion Protein in Pretargeted Radioimmunotherapy for B-cell Non-Hodgkin Lymphoma. Blood. 104 (1), 227 (2004).
- Kalofonos, H. P., et al. Imaging of Tumor in Patients with Indium-111-Labeled Biotin and Streptavidin-Conjugated Antibodies: Preliminary Communication. Journal of Nuclear Medicine. 31 (11), 1791-1796 (1990).
- Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54 (8), 1389-1396 (2013).
- Meyer, J. -. P., et al. 18F-Based Pretargeted PET Imaging Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 27 (2), 298-301 (2016).
- Rossin, R., Läppchen, T., vanden Bosch, S. M., Laforest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder Reaction for Tumor Pretargeting: In Vivo Chemistry Can Boost Tumor Radiation Dose Compared with Directly Labeled Antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54 (11), 1989-1995 (2013).
- Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Molecular Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide−Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. Journal of the American Chemical Society. 126 (46), 15046-15047 (2004).
- Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels−Alder Reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130 (41), 13518-13519 (2008).
- Houghton, J. L., et al. Establishment of the In Vivo Efficacy of Pretargeted Radioimmunotherapy Utilizing Inverse Electron Demand Diels-Alder Click Chemistry. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (1), 124-133 (2017).
- Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Carcinoma. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018).
- Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. Journal of Visualized Experiments. (96), e52335 (2015).
- Cook, B. E., Membreno, R., Zeglis, B. M. Dendrimer Scaffold for the Amplification of In Vivo Pretargeting Ligations. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2734-2740 (2018).
- Cheal, S. M., et al. Theranostic Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer Xenografts in Mice Using Picomolar Affinity Y-86- or Lu-177-DOTA-Bn Binding scFv C825/GPA33 IgG Bispecific Immunoconjugates. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 43 (5), 925-937 (2016).
- Meyer, J. -. P., et al. Bioorthogonal Masking of Circulating Antibody-TCO Groups Using Tetrazine-Functionalized Dextran Polymers. Bioconjugate Chemistry. 29 (2), 538-545 (2018).
- Houghton, J. L., et al. Pretargeted Immuno-PET of Pancreatic Cancer: Overcoming Circulating Antigen and Internalized Antibody to Reduce Radiation Doses. Journal of Nuclear Medicine. 57 (3), 453-459 (2016).
- Keinänen, O., et al. Pretargeting of Internalizing Trastuzumab and Cetuximab with a (18)F-Tetrazine Tracer in Xenograft Models. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Research. 7, 95 (2017).
- Billaud, E. M. F., et al. Micro-flow Photosynthesis of New Dienophiles for Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactions. Potential Applications for Pretargeted In Vivo PET Imaging. Chemical Science. 8 (2), 1251-1258 (2017).
