Pretargeted Radioimmunotherapy baseret på Inverse elektron efterspørgsel Diels-elletræ reaktion
Summary
Denne protokol beskriver syntese og karakterisering af en trans– cyclooctene (TCO)-modificeret antistof og en 177Lu-mærket tetrazine (Tz) radioligand for pretargeted radioimmunotherapy (ANNS). Derudover detaljer det brugen af disse to konstruktioner til i vivo biodistribution og langsgående terapi undersøgelser i en murine model af kolorektal cancer.
Abstract
Mens radioimmunotherapy (RIT) er en lovende metode til behandling af kræft, kan den lange farmakokinetiske half-life af radiolabeled antistoffer resultere i høje strålingsdoser til sundt væv. Måske ikke overraskende, er flere forskellige strategier blevet udviklet for at omgå denne bekymrende begrænsning. En af de mest lovende af disse tilgange er pretargeted radioimmunotherapy (ANNS). CONNIES er baseret på afkobling radionuklid fra immunoglobulin, indsprøjte dem separat, og derefter giver dem mulighed for at kombinere i vivo på målvæv. Denne tilgang udnytter de ekstraordinære tumor-targeting egenskaber af antistoffer mens fodpaneler deres farmakokinetiske ulemper, derved sænke stråledoser til ikke-målarter væv og lette anvendelsen af radionuklider med halveringstider, der er anses for kort til brug i traditionelle radioimmunoconjugates. I de sidste fem år, har vores laboratorium og andre udviklet en tilgang til i vivo pretargeting baseret på inverse elektron-demand Diels-elletræ (IEDDA) reaktion mellem trans– cyclooctene (TCO) og tetrazine (Tz). Denne strategi har været anvendt med succes til pretargeted positron emission tomografi (PET) og single photon emission computertomografi (SPECT), imaging med en række forskellige antigen-antistof systemer. I et par af de seneste publikationer, har vi vist effekten af IEDDA-baseret ANNS i murine modeller af pancreas duktalt adenokarcinom og colorectal karcinom. I denne protokol, vi beskriver protokoller for ANNS ved hjælp af en 177Lu-DOTA-mærket tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PIND7– Tz) og en TCO-modificeret variant af kolorektal kræft målretning huA33 antistof (huA33-TCO). Mere specifikt vil vi beskrive opbygningen af huA33-TCO, syntese og radiolabeling [177Lu] Lu-DOTA-PIND7– Tz, og ydeevne i vivo biodistribution og langsgående terapi undersøgelser i murine modeller af Colorectal karcinom.
Introduction
Radioimmunotherapy (RIT) — anvendelse af antistoffer til levering af terapeutiske radionuklider til tumorer – har længe været en lokkende tilgang til behandling af kræft1,2. Ja, dette løfte er blevet understreget af USA ‘s Food and Drug Administration godkendelse af to radioimmunoconjugates til behandling af Non-Hodgkins lymfom: 90Y-ibritumomab tiuxetan og 131-tositumomab3 , 4. men selv fra sine tidligste dage, kliniske udsigterne til RIT har været hæmmet af en kritisk komplikation: høj stråling dosishastigheder til sundt væv5,6. Generelt er radioimmunoconjugates til RIT er mærket med langlivede radionuklider (f.eks. 131jeg [t½ = 8,0 dage] og 90Y [t½ = 2,7 dage]) med fysiske halveringstid, som harmonerer godt med den længe farmakokinetiske halveringstid af immunoglobuliner. Det er afgørende, da det sikrer, at tilstrækkelige radioaktivitet er stadig når antistoffet har nået sin optimale biodistribution efter flere dage af omsætning. Men denne kombination af lang opholdstid i blod og længe fysiske halveringstid uundgåeligt resultater i bestråling af sunde væv, dermed reducere terapeutiske nøgletal og begrænse effekten af terapi7. Flere strategier har været undersøgt for at omgå dette problem, herunder afkortede antistof fragmenter såsom Fab, Fab’, F(ab’)2, minibodies og nanobodies8,9,10. En af de mest lovende og fascinerende, men unægtelig komplekse, alternative tilgange er i vivo pretargeting11.
In vivo pretargeting er en tilgang til nukleare billeddannelse og terapi, der søger at udnytte den udsøgte affinitet og selektivitet af antistoffer mens fodpaneler deres farmakokinetiske ulemper11,12,13. Med henblik herpå, den radiolabeled antistof anvendes i traditionelle radioimmunotherapy er dekonstrueret i to komponenter: en lille molekyle radioligand og en immunoconjugate, der kan binde både en tumor antigen og de ovennævnte radioligand. Immunoconjugate er indsprøjtet først og givet en ‘head start’, ofte i flere dage, hvor det ophobes i målvæv og rydder fra blodet. Efterfølgende, den lille molekyle radioligand administreres og kombinerer med immunoconjugate på tumor eller hurtigt rydder fra kroppen. I det væsentlige, i vivo pretargeting er afhængig af udfører radiokemi inden kroppen selv. Ved at reducere udbredelsen af radioaktivitet, denne tilgang samtidig reducerer stråledoser til sunde væv og letter brugen af radionuklider (f.eks. 68Ga, t½ = 68 min.211; Som t½ = 7,2 h) med halveringstider der er typisk betragtes som uforenelig med antistof-baserede vektorer.
Starter i slutningen af 1980 ‘ erne, en håndfuld forskellige tilgange til i vivo pretargeting er blevet udviklet, herunder strategier baseret på bispecific antistoffer, samspillet mellem streptavidin og biotin, og hybridisering af supplerende oligonukleotider14,15,16,17,18. Endnu har hver været holdt tilbage til varierende grader af komplikationer, mest berømt den potente immunogenicitet af streptavidin-ændret antistoffer19,20. I de sidste fem år, har vores gruppe og andre udviklet en tilgang til i vivo pretargeting baseret på den hurtige og bioorthogonal inverse elektron efterspørgsel Diels-elletræ ligatur mellem trans– cyclooctene (TCO) og tetrazine (Tz) 21,22,23,24. Den mest succesfulde af disse strategier har ansat en TCO-modificerede antistof og et Tz-bærende radioligand, som samlede ejeromkostninger er typisk mere stabil i vivo end dens Tz partner (figur 1)25,26. Som i andre pretargeting metoder, er mAb-TCO immunoconjugate administreres først og have tid til at rydde ud af cirkulation og ophobes i tumor væv. Derefter sprøjtes lille molekyle Tz radioligand, hvorefter det enten klikker med immunoconjugate i målvæv eller rydder hurtigt fra kroppen. Denne i vivo pretargeting strategien har vist sig meget effektiv til PET og SPECT imaging med flere forskellige antistof/antigen systemer, konsekvent producerer billeder med høj kontrast og at brugen af kortvarig radionuklider som 18 F (t½ = 109 min) og 64Cu (t1/2 = 12,7 h)21,22,24. Mere nylig, effekten af klik-baseret pretargeted radioimmunotherapy (ANNS) er blevet påvist i murine modeller af pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) og colorectal karcinom27,28. Til dette formål, terapeutiske radionuklid 177Lu (βmax = 498 keV, t1/2 = 6,7 dage) var ansat i forbindelse med to forskellige antistoffer: 5B1, som er rettet mod kulhydrater antigen 19,9 (CA19.9) allestedsnærværende udtrykt i PDAC , og huA33, som er rettet mod A33, en transmembrane glycoprotein udtrykt i > 95% af tyktarms-og endetarmskræft. I begge tilfælde, denne tilgang til 177Lu-ANNS givet høj aktivitetskoncentrationer i tumor væv, lavet en dosisafhængig terapeutisk virkning, og samtidig reduceret aktivitetskoncentrationer i sundt væv sammenlignet med traditionelle direkte-mærket radioimmunoconjugates.
I denne artikel vil vi beskrive protokoller for ANNS ved hjælp af en 177Lu-DOTA-mærket tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PIND7– Tz) og en TCO-modificeret variant af huA33 antistof (huA33-TCO). Mere specifikt, vi beskrive opbygningen af huA33-TCO (figur 2), syntese og radiolabeling [177Lu] Lu-DOTA-PIND7– Tz (figur 3 og figur 4), og udførelsen af in vivo Biodistribution og langsgående terapi undersøgelser i murine modeller af colorectal karcinom. Endvidere i de repræsentative resultater og diskussion, vi præsentere en eksempeldatasæt, adresse mulige strategier for optimering af denne tilgang, og overveje denne strategi i en bredere kontekst i vivo pretargeting og CONNIES. Endelig er det vigtigt at bemærke, at mens vi har valgt at fokusere på pretargeting ved hjælp af huA33-TCO og [177Lu] Lu-DOTA-PIND7– Tz i denne protokol, denne strategi er yderst modulopbygget og kan tilpasses til en bred vifte af antistoffer og radionuklider.
Protocol
Representative Results
Discussion
En af styrkerne ved denne tilgang til i vivo pretargeting — især i forhold til strategier baseret på bispecific antistoffer og radiolabeled habtener — er dens modularitet: trans– cyclooctene fraspaltning kan blive tilføjet til enhver antistof, og tetrazine radioligands kan være radiolabeled med en ekstraordinær bred vifte af radionuklider uden at forringe deres evne til at reagere med deres Klik partnere. Endnu er en tilpasning af denne tilgang til andre antistof/antigen system ikke så simpelt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Dr. Jacob Houghton for nyttige samtaler. Forfatterne vil også gerne takke NIH for deres generøse støtte (R00CA178205 og U01CA221046).
Materials
| (E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) | Sigma-Aldrich | 764523 | Store at -80 °C |
| 2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) | Sigma-Aldrich | 764701 | Store at -80 °C |
| Acetonitrile (MeCN) | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Ammonium Acetate (NH4OAc) | Fisher Scientific | A639-500 | |
| Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 70023 | Store at -20 °C |
| Dichloromethane (DCM) | Fisher Scientific | D143-1 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous | Fisher Scientific | D12345 | |
| EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | Fisher Scientific | UFC205024 | |
| GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous | Fisher Scientific | AC610941000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 70-011-044 | 10x Concentrated |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -20 °C |
| Triethylamine (TEA) | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | A116-50 | |
| Tumor measuring device | Peira TM900 | Peira TM900 |
Referências
- Goldenberg, D. M. Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies. Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).
- Goldenberg, D. M., et al. Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Antibody. Journal of Clinical Oncology. 9 (4), 548-564 (1991).
- Kaminski, M. S., et al. Radioimmunotherapy with 131I-Tositumomab for Relapsed or Refractory B-cell non-Hodgkin Lymphoma: Updated Results and Long-Term Follow-Up of the University of Michigan Experience. Blood. 96 (4), 1259-1266 (2000).
- Davies, A. J. Radioimmunotherapy for B-cell Lymphoma: Y90 Ibritumomab Tiuxetan and I131 Tositumomab. Oncogene. 26, 3614 (2007).
- Rajendran, J., et al. Comparison of Radiation Dose Estimation for Myeloablative Radioimmunotherapy for Relapsed or Recurrent Mantle Cell Lymphoma Using 131I Tositumomab to That of Other Types of Non-Hodgkin’s Lymphoma. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 19 (6), 738-745 (2004).
- Rajendran, J. G., et al. High-Dose 131I-Tositumomab (Anti-CD20) Radioimmunotherapy for Non-Hodgkin’s Lymphoma: Adjusting Radiation Absorbed Dose to Actual Organ Volumes. Journal of Nuclear Medicine. 45 (6), 1059-1064 (2004).
- Larson, S. M., Carrasquillo, J. A., Cheung, N. -. K. V., Press, O. Radioimmunotherapy of Human tumours. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 347-360 (2015).
- Kelly, M. P., et al. Tumor Targeting by a Multivalent Single-Chain Fv (scFv) Anti-Lewis Y Antibody Construct. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 23 (4), 411-423 (2008).
- Yazaki, P. J., et al. Tumor Targeting of Radiometal Labeled Anti-CEA Recombinant T84.66 Diabody and T84.66 Minibody: Comparison to Radioiodinated Fragments. Bioconjugate Chemistry. 12 (2), 220-228 (2001).
- van Duijnhoven, S. M. J., et al. Diabody Pretargeting with Click Chemistry In Vivo. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1422-1428 (2015).
- Altai, M., Membreno, R., Cook, B., Tolmachev, V., Zeglis, B. M. Pretargeted Imaging and Therapy. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1553-1559 (2017).
- Goldenberg, D. M., Chatal, J. -. F., Barbet, J., Boerman, O., Sharkey, R. M. Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting. Update on cancer therapeutics. 2 (1), 19-31 (2007).
- Rossin, R., et al. In-Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angewandte Chemie International Edition. 49 (19), 3375-3378 (2010).
- Gestin, J. F., et al. Two-Step Targeting of Xenografted Colon Carcinoma Using a Bispecific Antibody and 188Re-Labeled Bivalent Hapten: Biodistribution and Dosimetry Studies. Journal of Nuclear Medicine. 42 (1), 146-153 (2001).
- Green, D. J., et al. Comparative Analysis of Bispecific Antibody and Streptavidin-Targeted Radioimmunotherapy for B-cell Cancers. Pesquisa do Câncer. 76 (22), 6669 (2016).
- Sharkey, R. M., et al. Development of a Streptavidin−Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody, Radiolabeled Biotin Pretargeting Method for Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer. Studies in a Human Colon Cancer Xenograft Model. Bioconjugate Chemistry. 8 (4), 595-604 (1997).
- Knox, S. J., et al. Phase II Trial of Yttrium-90-DOTA-Biotin Pretargeted by NR-LU-10 Antibody/Streptavidin in Patients with Metastatic Colon Cancer. Clinical Cancer Research. 6 (2), 406 (2000).
- Schubert, M., et al. Novel Tumor Pretargeting System Based on Complementary L-Configured Oligonucleotides. Bioconjugate Chemistry. 28 (4), 1176-1188 (2017).
- Forero, A., et al. Phase 1 Trial of a Novel Anti-CD20 Fusion Protein in Pretargeted Radioimmunotherapy for B-cell Non-Hodgkin Lymphoma. Blood. 104 (1), 227 (2004).
- Kalofonos, H. P., et al. Imaging of Tumor in Patients with Indium-111-Labeled Biotin and Streptavidin-Conjugated Antibodies: Preliminary Communication. Journal of Nuclear Medicine. 31 (11), 1791-1796 (1990).
- Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54 (8), 1389-1396 (2013).
- Meyer, J. -. P., et al. 18F-Based Pretargeted PET Imaging Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 27 (2), 298-301 (2016).
- Rossin, R., Läppchen, T., vanden Bosch, S. M., Laforest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder Reaction for Tumor Pretargeting: In Vivo Chemistry Can Boost Tumor Radiation Dose Compared with Directly Labeled Antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54 (11), 1989-1995 (2013).
- Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Molecular Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide−Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. Journal of the American Chemical Society. 126 (46), 15046-15047 (2004).
- Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels−Alder Reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130 (41), 13518-13519 (2008).
- Houghton, J. L., et al. Establishment of the In Vivo Efficacy of Pretargeted Radioimmunotherapy Utilizing Inverse Electron Demand Diels-Alder Click Chemistry. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (1), 124-133 (2017).
- Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Carcinoma. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018).
- Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. Journal of Visualized Experiments. (96), e52335 (2015).
- Cook, B. E., Membreno, R., Zeglis, B. M. Dendrimer Scaffold for the Amplification of In Vivo Pretargeting Ligations. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2734-2740 (2018).
- Cheal, S. M., et al. Theranostic Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer Xenografts in Mice Using Picomolar Affinity Y-86- or Lu-177-DOTA-Bn Binding scFv C825/GPA33 IgG Bispecific Immunoconjugates. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 43 (5), 925-937 (2016).
- Meyer, J. -. P., et al. Bioorthogonal Masking of Circulating Antibody-TCO Groups Using Tetrazine-Functionalized Dextran Polymers. Bioconjugate Chemistry. 29 (2), 538-545 (2018).
- Houghton, J. L., et al. Pretargeted Immuno-PET of Pancreatic Cancer: Overcoming Circulating Antigen and Internalized Antibody to Reduce Radiation Doses. Journal of Nuclear Medicine. 57 (3), 453-459 (2016).
- Keinänen, O., et al. Pretargeting of Internalizing Trastuzumab and Cetuximab with a (18)F-Tetrazine Tracer in Xenograft Models. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Research. 7, 95 (2017).
- Billaud, E. M. F., et al. Micro-flow Photosynthesis of New Dienophiles for Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactions. Potential Applications for Pretargeted In Vivo PET Imaging. Chemical Science. 8 (2), 1251-1258 (2017).
