Pretargeted Radioimmunotherapy basato sulla reazione di Diels-Alder domanda inversa Electron
Summary
Questo protocollo descrive la sintesi e la caratterizzazione di un trans– ciclottene (TCO)-anticorpo e un radioligand tetrazine Lu-etichettati (Tz) 177per pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) modifica. Inoltre, vi si descrive l’uso di questi due costrutti di biodistribuzione in vivo e studi longitudinali terapia in un modello murino di cancro colorettale.
Abstract
Mentre radioimmunoterapia (RIT) è un approccio promettente per il trattamento del cancro, l’emivita lunga farmacocinetica degli anticorpi radiomarcati può provocare dosi di alta radiazione ai tessuti sani. Forse non a caso, diverse strategie differenti sono state sviluppate per aggirare questa limitazione preoccupante. Uno dei più promettenti di questi approcci è pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT si basa sul disaccoppiamento radionuclide dall’immunoglobulina, iniettando loro separatamente e quindi consentendo loro di combinare in vivo presso il tessuto bersaglio. Questo approccio sfrutta le eccezionali proprietà di targeting tumorale di anticorpi costeggiando i loro svantaggi farmacocinetiche, quindi riducendo le dosi di radiazione ai tessuti non bersaglio e facilitare l’uso di radionuclidi con emivite che sono considerato troppo breve per uso in radioimmunoconjugates tradizionale. Negli ultimi cinque anni, il nostro laboratorio ed altri hanno sviluppato un approccio in vivo pretargeting basato sulla reazione di Diels-Alder (IEDDA) dell’elettrone-domanda inversa tra trans– ciclottene (TCO) e tetrazine (Tz). Questa strategia è stata applicata con successo a pretargeted tomografia a emissione di positroni (PET) ed emissione del singolo-fotone tomografia (SPECT) imaging con una varietà di sistemi antigene-anticorpo. In un paio di pubblicazioni recenti, abbiamo dimostrato l’efficacia di PRIT basati su IEDDA in modelli murini di adenocarcinoma duttale pancreatico e carcinoma colorettale. In questo protocollo, descriviamo protocolli per PRIT utilizzando un 177Lu-DOTA-etichettati tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz) e una variante di TCO-modificato del cancro colorettale targeting huA33 anticorpo (huA33-TCO). Più specificamente, descriveremo la costruzione di huA33-TCO, la sintesi e radiolabeling [177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz e le prestazioni di biodistribuzione in vivo e studi longitudinali terapia in modelli murini di carcinoma colorettale.
Introduction
Radioimmunoterapia (RIT) — l’uso degli anticorpi per la consegna dei radionuclidi terapeutici ai tumori — è stata a lungo un seducente approccio per il trattamento di cancro1,2. Infatti, questa promessa è stata sottolineata dalla United States Food and Drug Administration l’approvazione di due radioimmunoconjugates per il trattamento del linfoma Non-Hodgkin: 90Y-ibritumomab tiuxetano e 131-tositumomab3 , 4. ma anche dai suoi primi giorni, le prospettive cliniche di RIT sono state ostacolate da una complicazione critica: intensità di dose elevata radiazione ai tessuti sani5,6. In generale, radioimmunoconjugates per RIT sono etichettati con radionuclidi piu ‘ longevi (ad es., 131io [t½ = 8,0 giorni] e 90Y [t½ = 2,7 giorni]) con emivite fisiche che si incastrano bene con il emivita lunga farmacocinetica delle immunoglobuline. Questo è essenziale, in quanto garantisce che la radioattività sufficiente rimane una volta che l’anticorpo ha raggiunto la biodistribuzione ottimale dopo diversi giorni di circolazione. Tuttavia, questa combinazione di tempi di permanenza lunga nel sangue ed emivita lunga fisica comporta inevitabilmente l’irradiazione dei tessuti sani, riducendo i rapporti terapeutici e limitare l’efficacia della terapia7. Diverse strategie sono state esplorate per aggirare questo problema, compreso l’uso di frammenti anticorpali troncato come Fab, Fab’, punto2, minibodies e nanobodies8,9,10. Uno dei più promettenti e affascinante, ma innegabilmente complessi approcci alternativi è in vivo pretargeting11.
In vivo pretargeting è un approccio alla terapia che cerca di sfruttare la squisita affinità e selettività degli anticorpi bordando loro farmacocinetica inconvenienti11,12,13e imaging nucleare. A tal fine, l’anticorpo radioattivo utilizzato nel tradizionale radioimmunotherapy viene decostruito in due componenti: una piccola molecola radioligand e un immunoconjugate che può legarsi sia un antigene tumorale e il suddetto radioligand. Il immunoconjugate è iniettato prima e dato un ‘vantaggio’, spesso parecchi giorni, durante i quali si accumula nel tessuto bersaglio e Cancella dal sangue. Successivamente, la piccola molecola radioligand è amministrato e combina con il immunoconjugate al tumore o cancella rapidamente dal corpo. In sostanza, in vivo pretargeting si basa sulla esecuzione di radiochimica all’interno del corpo stesso. Riducendo la circolazione della radioattività, questo approccio riduce le dosi di radiazione ai tessuti sani e facilita l’uso di radionuclidi contemporaneamente (ad es., 68Ga, t½ = 68 min211; Come, t½ = 7,2 h) con emivite che in genere sono considerate incompatibili con i vettori di base di anticorpi.
A partire nel tardo 1980, sono stati sviluppati una manciata di diversi approcci per in vivo pretargeting, comprese strategie basate sugli anticorpi anticorpo, l’interazione tra streptavidina e biotina e l’ibridazione di complementari oligonucleotidi14,15,16,17,18. Eppure ognuno è stata frenata a vari gradi di complicazioni, più notoriamente l’immunogenicità potente di anticorpi streptavidina-modificato19,20. Negli ultimi cinque anni, il nostro gruppo e altri hanno sviluppato un approccio in vivo pretargeting basato sulla rapida e bioorthogonal inversa electron demand Diels-Alder legatura tra trans– ciclottene (TCO) e tetrazine (Tz) 21,22,23,24. Il maggior successo di queste strategie hanno impiegato un anticorpo TCO-modificato e un radioligand Tz-cuscinetto, come TCO è in genere più stabile in vivo oltre la Tz partner (Figura 1)25,26. Come in altre metodologie pretargeting, il immunoconjugate mAb-TCO è amministrato in primo luogo e dato il tempo di cancellare dalla circolazione e si accumulano nel tessuto del tumore. Successivamente, la piccola molecola Tz radioligand viene iniettato, dopo di che fa clic con il immunoconjugate all’interno del tessuto bersaglio o cancella rapidamente dal corpo. Questo in vivo pretargeting strategia si è dimostrato altamente efficace per PET e SPECT imaging con diversi sistemi di diversi anticorpi e antigeni, costantemente producendo immagini con contrasto elevato e consentendo l’uso di radionuclidi di breve durata come 18 F (t½ = 109 min) e 64Cu (t1/2 = 12.7 ore)21,22,24. Più recentemente, l’efficacia di basati su clic pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) è stata dimostrata in modelli murini di adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) e carcinoma colorettale27,28. A tal fine, i radionuclidi terapeutici 177Lu (βmax = 498 keV, t1/2 = 6,7 giorni) è stato impiegato in combinazione con due differenti anticorpi: 5B1, che si rivolge l’antigene carboidratico 19.9 (CA 19.9) espressa ubiquitariamente in PDAC , e huA33, che si rivolge A33, una glicoproteina transmembrana espressa in > 95% dei cancri colorettali. In entrambi i casi, questo approccio a 177Lu-PRIT ha reso le concentrazioni di alta attività nel tessuto del tumore, ha creato un effetto terapeutico dose-dipendente e contemporaneamente ridotte concentrazioni di attività in tessuti sani rispetto ai tradizionali direttamente-con l’etichetta radioimmunoconjugates.
In questo articolo, descriviamo i protocolli per PRIT utilizzando un 177Lu-DOTA-etichettati tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz) e una variante di TCO-modificato dell’anticorpo huA33 (huA33-TCO). Più specificamente, descriviamo la costruzione di huA33-TCO (Figura 2), la sintesi e radiolabeling [177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz (Figura 3 e Figura 4) e le prestazioni di in vivo biodistribuzione e terapia longitudinale studi in modelli murini di carcinoma colorettale. Inoltre, nei risultati rappresentativi e discussione, presentiamo un set di dati campione, possibili strategie di indirizzo per l’ottimizzazione di questo approccio e considerare questa strategia nel contesto più ampio di in vivo pretargeting e PRIT. Infine, è importante notare che mentre abbiamo scelto di concentrarsi su pretargeting utilizzando huA33-TCO e [177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz in questo protocollo, questa strategia è altamente modulare e può essere adattato per soddisfare una vasta gamma di anticorpi e radionuclidi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uno dei punti di forza di questo approccio per in vivo pretargeting — soprattutto in relazione alle strategie fondate sugli anticorpi anticorpo e radioattivi apteni — è la sua modularità: trans– ciclottene moiety possono essere aggiunti a qualsiasi anticorpo, e tetrazine radioligands possono essere radioattivi con una straordinaria varietà di radionuclidi senza alterare la loro capacità di reagire con i loro partner di clic. Ancora l’adattamento di questo approccio per altri sistemi antigene/ant…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. Jacob Houghton per conversazioni utili. Gli autori inoltre ringraziare il NIH per loro generosi finanziamenti (R00CA178205 e U01CA221046).
Materials
| (E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) | Sigma-Aldrich | 764523 | Store at -80 °C |
| 2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) | Sigma-Aldrich | 764701 | Store at -80 °C |
| Acetonitrile (MeCN) | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Ammonium Acetate (NH4OAc) | Fisher Scientific | A639-500 | |
| Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 70023 | Store at -20 °C |
| Dichloromethane (DCM) | Fisher Scientific | D143-1 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous | Fisher Scientific | D12345 | |
| EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | Fisher Scientific | UFC205024 | |
| GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous | Fisher Scientific | AC610941000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 70-011-044 | 10x Concentrated |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -20 °C |
| Triethylamine (TEA) | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | A116-50 | |
| Tumor measuring device | Peira TM900 | Peira TM900 |
Referências
- Goldenberg, D. M. Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies. Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).
- Goldenberg, D. M., et al. Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Antibody. Journal of Clinical Oncology. 9 (4), 548-564 (1991).
- Kaminski, M. S., et al. Radioimmunotherapy with 131I-Tositumomab for Relapsed or Refractory B-cell non-Hodgkin Lymphoma: Updated Results and Long-Term Follow-Up of the University of Michigan Experience. Blood. 96 (4), 1259-1266 (2000).
- Davies, A. J. Radioimmunotherapy for B-cell Lymphoma: Y90 Ibritumomab Tiuxetan and I131 Tositumomab. Oncogene. 26, 3614 (2007).
- Rajendran, J., et al. Comparison of Radiation Dose Estimation for Myeloablative Radioimmunotherapy for Relapsed or Recurrent Mantle Cell Lymphoma Using 131I Tositumomab to That of Other Types of Non-Hodgkin’s Lymphoma. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 19 (6), 738-745 (2004).
- Rajendran, J. G., et al. High-Dose 131I-Tositumomab (Anti-CD20) Radioimmunotherapy for Non-Hodgkin’s Lymphoma: Adjusting Radiation Absorbed Dose to Actual Organ Volumes. Journal of Nuclear Medicine. 45 (6), 1059-1064 (2004).
- Larson, S. M., Carrasquillo, J. A., Cheung, N. -. K. V., Press, O. Radioimmunotherapy of Human tumours. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 347-360 (2015).
- Kelly, M. P., et al. Tumor Targeting by a Multivalent Single-Chain Fv (scFv) Anti-Lewis Y Antibody Construct. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 23 (4), 411-423 (2008).
- Yazaki, P. J., et al. Tumor Targeting of Radiometal Labeled Anti-CEA Recombinant T84.66 Diabody and T84.66 Minibody: Comparison to Radioiodinated Fragments. Bioconjugate Chemistry. 12 (2), 220-228 (2001).
- van Duijnhoven, S. M. J., et al. Diabody Pretargeting with Click Chemistry In Vivo. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1422-1428 (2015).
- Altai, M., Membreno, R., Cook, B., Tolmachev, V., Zeglis, B. M. Pretargeted Imaging and Therapy. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1553-1559 (2017).
- Goldenberg, D. M., Chatal, J. -. F., Barbet, J., Boerman, O., Sharkey, R. M. Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting. Update on cancer therapeutics. 2 (1), 19-31 (2007).
- Rossin, R., et al. In-Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angewandte Chemie International Edition. 49 (19), 3375-3378 (2010).
- Gestin, J. F., et al. Two-Step Targeting of Xenografted Colon Carcinoma Using a Bispecific Antibody and 188Re-Labeled Bivalent Hapten: Biodistribution and Dosimetry Studies. Journal of Nuclear Medicine. 42 (1), 146-153 (2001).
- Green, D. J., et al. Comparative Analysis of Bispecific Antibody and Streptavidin-Targeted Radioimmunotherapy for B-cell Cancers. Pesquisa do Câncer. 76 (22), 6669 (2016).
- Sharkey, R. M., et al. Development of a Streptavidin−Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody, Radiolabeled Biotin Pretargeting Method for Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer. Studies in a Human Colon Cancer Xenograft Model. Bioconjugate Chemistry. 8 (4), 595-604 (1997).
- Knox, S. J., et al. Phase II Trial of Yttrium-90-DOTA-Biotin Pretargeted by NR-LU-10 Antibody/Streptavidin in Patients with Metastatic Colon Cancer. Clinical Cancer Research. 6 (2), 406 (2000).
- Schubert, M., et al. Novel Tumor Pretargeting System Based on Complementary L-Configured Oligonucleotides. Bioconjugate Chemistry. 28 (4), 1176-1188 (2017).
- Forero, A., et al. Phase 1 Trial of a Novel Anti-CD20 Fusion Protein in Pretargeted Radioimmunotherapy for B-cell Non-Hodgkin Lymphoma. Blood. 104 (1), 227 (2004).
- Kalofonos, H. P., et al. Imaging of Tumor in Patients with Indium-111-Labeled Biotin and Streptavidin-Conjugated Antibodies: Preliminary Communication. Journal of Nuclear Medicine. 31 (11), 1791-1796 (1990).
- Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54 (8), 1389-1396 (2013).
- Meyer, J. -. P., et al. 18F-Based Pretargeted PET Imaging Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 27 (2), 298-301 (2016).
- Rossin, R., Läppchen, T., vanden Bosch, S. M., Laforest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder Reaction for Tumor Pretargeting: In Vivo Chemistry Can Boost Tumor Radiation Dose Compared with Directly Labeled Antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54 (11), 1989-1995 (2013).
- Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Molecular Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide−Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. Journal of the American Chemical Society. 126 (46), 15046-15047 (2004).
- Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels−Alder Reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130 (41), 13518-13519 (2008).
- Houghton, J. L., et al. Establishment of the In Vivo Efficacy of Pretargeted Radioimmunotherapy Utilizing Inverse Electron Demand Diels-Alder Click Chemistry. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (1), 124-133 (2017).
- Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Carcinoma. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018).
- Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. Journal of Visualized Experiments. (96), e52335 (2015).
- Cook, B. E., Membreno, R., Zeglis, B. M. Dendrimer Scaffold for the Amplification of In Vivo Pretargeting Ligations. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2734-2740 (2018).
- Cheal, S. M., et al. Theranostic Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer Xenografts in Mice Using Picomolar Affinity Y-86- or Lu-177-DOTA-Bn Binding scFv C825/GPA33 IgG Bispecific Immunoconjugates. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 43 (5), 925-937 (2016).
- Meyer, J. -. P., et al. Bioorthogonal Masking of Circulating Antibody-TCO Groups Using Tetrazine-Functionalized Dextran Polymers. Bioconjugate Chemistry. 29 (2), 538-545 (2018).
- Houghton, J. L., et al. Pretargeted Immuno-PET of Pancreatic Cancer: Overcoming Circulating Antigen and Internalized Antibody to Reduce Radiation Doses. Journal of Nuclear Medicine. 57 (3), 453-459 (2016).
- Keinänen, O., et al. Pretargeting of Internalizing Trastuzumab and Cetuximab with a (18)F-Tetrazine Tracer in Xenograft Models. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Research. 7, 95 (2017).
- Billaud, E. M. F., et al. Micro-flow Photosynthesis of New Dienophiles for Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactions. Potential Applications for Pretargeted In Vivo PET Imaging. Chemical Science. 8 (2), 1251-1258 (2017).
