Pretargeted Radioimmunotherapy 역 전자 수요 Diels 오리 나무 반응에 따라

Summary

이 프로토콜 합성 및 트랜스-cyclooctene (TCO)의 특성에 설명 합니다-항 체와 ¹⁷⁷루 표시 tetrazine (Tz) radioligand pretargeted radioimmunotherapy (PRIT)에 대 한 수정. 또한, 그것은 자세히 biodistribution vivo에서 및 colorectal 암의 murine 모델에 경도 치료 연구에 대 한 이러한 두 가지 구조를 사용 하 여를 설명합니다.

Abstract

Radioimmunotherapy (RIT) 암 치료에 대 한 유망한 접근은, 건강 한 조직에 높은 방사선 복용량 방사선된 항 체의 긴 pharmacokinetic 반감기 발생할 수 있습니다. 아마 당연한 일로, 여러 가지 다른 전략이 문제가 제한 우회 개발 되었습니다. 이러한 접근의 가장 유망한 중 하나입니다 pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT는 비보에 대상 조직에 결합 하는 면역 글로불린에서 방사성 핵 종 분리, 별도로, 그들에 게 주입 하 고 다음 있도록에 입각 한입니다. 이 이렇게 pharmacokinetic 그들의 단점을 굽 도리 널, 그로 인하여 비 표적 조직에 방사선 복용량을 낮추는 고 반감기를 가진 방사성 핵의 사용을 촉진 하는 동안 항 체의 뛰어난 종양을 대상으로 속성을 보여준다 전통적인 radioimmunoconjugates에 대 한 너무 짧은 사용으로 간주 됩니다. 지난 5 년 동안 우리의 실험실과 다른 비보에 트랜스-cyclooctene (TCO) 및 tetrazine (Tz) 사이 역 전자-수요 Diels 오리 나무 (IEDDA) 반응에 따라 pretargeting에 대 한 접근을 개발 했습니다. 이 전략을 성공적으로 pretargeted 양전자 방출 단층 촬영 (PET)에 적용 된 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT) 항 체-항 원 시스템의 다양 한 이미징 및. 최근 간행물의 쌍, 우리 IEDDA 기반 PRIT 췌 장 ductal 선 암과 대 장 암 murine 모델에서의 효능을 증명 하고있다. 이 프로토콜에서 ¹⁷⁷루 DOTA 라는 tetrazine radioligand를 사용 하 여 PRIT에 대 한 프로토콜 설명 ([¹⁷⁷루] 루-DOTA-말뚝₇-Tz)와 huA33 항 체 (huA33-TCO)을 대상으로 대 장 암의 TCO 수정 변종. 좀 더 구체적으로, 우리 huA33 TCO, 합성 [¹⁷⁷루]의 radiolabeling 루-DOTA-말뚝₇의 건설을 설명 합니다-Tz, vivo에서 biodistribution와 murine 모델에서 경도 치료 연구의 성과 대 장 암입니다.

Introduction

Radioimmunotherapy (RIT)-사용 항 체의 종양 치료 방사성의 배달에 대 한-긴 암^1,2의 치료에 대 한 유혹 접근 되었습니다. 실제로,이 약속 했다 비-Hodgkin의 림프 종 치료에 대 한 두 개의 radioimmunoconjugates의 미국 식품 및 의약품 안전 청의 승인에 의해 강조 되었습니다: ⁹⁰Y ibritumomab tiuxetan 및 ¹³¹-tositumomab^{3 , 4}. 초기 일에서 새끼의 임상 전망 중요 한 합병증에 의해 방해 되어 아직: 건강 한 조직이^5,6높은 방사선 복용량 비율. 일반적으로 말하자면, 미 모에 대 한 radioimmunoconjugates 수명이 긴 방사성 표시 됩니다 (예: ¹³¹나 [t_½ = 8.0 일] ⁹⁰Y [t_½ = 2.7 일]) 물리적 반감기와 잘 사 개 그와 면역 글로불린의 긴 pharmacokinetic 절반-삶입니다. 이것은 필수, 그 충분 한 방사능 항 체의 최적의 biodistribution 순환의 몇 일 후에 도달 되 면 남아 보장. 그러나,이 긴 거주 시간 혈액에 긴 물리적 반감기의 필연적 결과이 조합 하지 함으로써 치료 비율을 감소 하 고 제한 치료⁷의 효능 건강 한 조직에의 방사선 조사에. 여러 전략 잘린된 항 체 파편 팹, 팹 등의 사용을 포함 하 여이 문제를 회피 하 탐험 되어 ‘, F(ab’)₂, minibodies, 및 nanobodies^8,,910. 한의 가장 유망 하 고 매혹적인, 아직 명백 하 게 복잡 한, 대체 접근에 vivo에서 ¹¹pretargeting입니다.

Vivo에서 pretargeting 핵 영상과 치료 그들의 pharmacokinetic 단점^11,,1213를 굽 도리 널 하면서 절묘 한 선호도 및 항 체의 선택도 활용 하고자 하는 접근 이다. 이 위해, 전통적인 radioimmunotherapy에서 이용 된 방사선된 항 체는 두 가지 구성 요소에 deconstructed: 작은 분자 radioligand와는 immunoconjugate 종양 항 원 및 상기 radioligand 모두 바인딩할 수 있습니다. immunoconjugate 먼저 주입 하 고 주어진 ‘ 시작 ‘, 종종 몇 일 동안 그것은 대상 조직에 축적 하 고 혈액에서 지웁니다. 그 후, 작은 분자 radioligand 관리 하 고 종양에 immunoconjugate와 결합 하거나 빠르게 시체에서 지웁니다. 본질적으로, vivo에서 pretargeting radiochemistry 본문 자체 내에서 수행 시 사용 합니다. 방사능의 순환을 줄임으로써,이 이렇게 동시에 건강 한 조직에 방사선 복용량을 감소 하 고 방사성 핵의 사용을 용이 하 게 (예를 들어, ⁶⁸가 t_½ = 68 분²¹¹; 로, t_½ = 7.2 h) 일반적으로 항 체 기반 벡터와 호환 되지 않는 여겨진다 절반 생활.

1980 년대 후반에 시작, vivo에서 pretargeting에 다른 접근의 개발 되었으며, bispecific 항 체, streptavidin 비타민 b 복합체, 사이 상호 작용에 따라 전략을 포함 하 여 및 보완의 교 잡 oligonucleotides^{14,15,,1617,18}. 아직 각 개최 되었습니다 다시 다양 한 각도에 합병증, 항 체 streptavidin 수정^19,20의 가장 고 명 하 게 강력한 immunogenicity 여. 지난 5 년 동안, 우리의 그룹 및 다른 사람 vivo에서 pretargeting는 급속 및 bioorthogonal 역 전자 수요 Diels 오리 나무 결 찰 트랜스-cyclooctene (TCO) 및 tetrazine (Tz) ^{사이 기반에 대 한 접근을 개발 했습니다. 21,22,,2324}. 이 전략의 가장 성공적인 고용 했다 TCO 수정 항 체 및 Tz 베어링 radioligand, TCO는 일반적으로 더 안정 된 vivo에서 Tz 파트너 (그림 1)^25,26보다. 다른 pretargeting 방법론에서 mAb TCO immunoconjugate 먼저 관리 하 고 순환에서 하 고 종양 조직에 축적 하는 시간을 주어진. 그 후, 작은 분자 Tz radioligand은 주입 후 대상 조직 내의 immunoconjugate와 함께 클릭 하거나 시체에서 급속 하 게 지웁니다. 이 비보에 전략 pretargeting 입증 되었습니다 매우 효과적인 애완 동물 SPECT 여러 다른 항 체/항 원 시스템 이미징, 지속적으로 높은 콘트라스트 이미지를 생산 및 같은 수명이 짧은 방사성 핵의 사용을 활성화 ¹⁸ F (t_½ = 109 분)와 ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12.7 h)^21,,2224. 더 최근에, 클릭에 기초를 둔 pretargeted radioimmunotherapy (PRIT)의 효능 췌 장 ductal 선 (PDAC) 암 및 대 장 암^27,28murine 모델에서 증명 되었습니다. 이 위해 치료 방사성 핵 종 ¹⁷⁷루 (β_최대 498 = 케빈, t_1/2 = 6.7 일) 두 개의 서로 다른 항 체와 함께에서 고용 되었다: 5B1, 탄수화물 항 원 19.9 (CA19.9) 편 PDAC 표현 대상 huA33, A33, 대상 막 횡단 당단백질 표현 > 대 장 암의 95%. 두 경우 모두, ¹⁷⁷Lu PRIT를이 이렇게 종양 조직에 높은 활동 농도 굴복, 복용량-의존 치료 효과 만들고 동시에 전통에 비해 건강 한 조직에 활동 농도 감소 직접 표시 된 radioimmunoconjugates입니다.

이 문서에서는, 우리는 ¹⁷⁷루 DOTA 라는 tetrazine radioligand를 사용 하 여 PRIT에 대 한 프로토콜을 설명 ([¹⁷⁷루] 루-DOTA-말뚝₇-Tz)와 huA33 항 체 (huA33-TCO)의 TCO 수정 변종. 좀 더 구체적으로, 우리는 huA33-TCO (그림 2), 합성 및 [¹⁷⁷루]의 radiolabeling 루-DOTA-말뚝₇의 건축 설명-Tz (그림 3 및 그림 4), 그리고 에 비보 의 성능 biodistribution 고 대 장 암의 murine 모델에 경도 치료 연구. 또한, 대표적인 결과에 토론, 우리 샘플 데이터 집합,이 방법의 최적화에 대 한 주소 가능한 전략을 제시 하 고 vivo에서 pretargeting 및 PRIT의 넓은 맥락에서이 전략을 고려 하십시오. 마지막으로, 우리 huA33-TCO와 [¹⁷⁷루]를 사용 하 여 pretargeting에 초점을 선택 하는 동안 루-DOTA-말뚝₇이 프로토콜,이 전략에서에서-Tz 높은 모듈식 이며 다양 한 항 체에 맞게 적용할 수 있습니다 중요 하다 고 방사성 핵 종입니다.

Protocol

모든 vivo에서 동물 실험이이 작업에 설명 된 승인 된 프로토콜에 따라 수행 되었고 기념 슬로 안 Kettering 암 센터, Weill 코넬 의료 센터, 그리고 사냥꾼 대학의 윤리 지침에 따라 실행 제도 동물 보호와 사용 위원회 (IACUC) 1. huA33-TCO의 준비 참고: huA33 TCO의 합성 이전에 보고 된29되었습니다. 그러나, 독자의 용이성, 그것은 복제 여기 최?…

Representative Results

HuA33에 TCO의 활용 아민 반응 TCO NHS와는 면역 글로불린의 표면에 리 진 잔류물 간의 결합에 입각 한입니다. 이 메서드는 매우 강력 하 고 재현할 수 하 고 안정적으로도-의-라벨 2-4 TCO/mAb의 생성 합니다. 이 경우, MALDI ToF 질량 분석 약 4.0 TCO/mAb;의 라벨의 정도 확인 하 고용 했다 비슷한 가치 기자24fluorophore 수정 tetrazine를 사용 하 여 얻은 했다. Tetrazine ligand의 …

Discussion

Vivo에서 pretargeting에이 방법의 장점 중 하나-bispecific 항 체에 입각 한 전략에 관하여 특히 고 haptens 방사선-그것의 모듈화는: 트랜스-cyclooctene moieties 어떤 항 체에 추가 될 수 있습니다 그리고 tetrazine radioligands 자신의 클릭 파트너와 함께 반응 하는 능력을 방해 하지 않고 방사성의 특별 한 다양 한 방사선 될 수 있습니다. 아직 다른 항 체/항 원 시스템에이 방법의 적응 하기만 하면 여?…

Materials

(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS)	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS)	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN)	Fisher Scientific	A998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc)	Fisher Scientific	A639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol)	Sigma-Aldrich	70023	Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM)	Fisher Scientific	D143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Fisher Scientific	D12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit	Fisher Scientific	UFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns	Fisher Scientific	45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous	Fisher Scientific	AC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	70-011-044	10x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTA	Macrocyclics	B-205	Store at -20 °C
Triethylamine (TEA)	Fisher Scientific	AC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA)	Fisher Scientific	A116-50
Tumor measuring device	Peira TM900	Peira TM900