Pretargeted Radioimmunotherapy basert på Inverse Electron etterspørsel Diels-Alderreaksjonen

Summary

Denne protokollen beskriver syntese og karakterisering av en trans– cyclooctene (TCO)-endret antistoff og en ¹⁷⁷Lu-merket tetrazine (Tz) radioligand for pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). I tillegg detaljer det bruken av disse to konstruerer for i vivo biodistribution og langsgående terapi studier i en murine modell av tykktarmskreft.

Abstract

Mens radioimmunotherapy (RIT) er en lovende metode for behandling av kreft, kan lenge farmakokinetiske halveringstiden av radiolabeled antistoffer resultere i høye Stråledoser sunt vev. Kanskje ikke overraskende, er flere forskjellige strategier utviklet for å omgå denne problematisk begrensningen. En av de mest lovende disse tilnærmingene er pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT forutsetter at dekopling radionuklidenes fra immunglobulin injisere dem separat og deretter la dem å kombinere i vivo på vevet. Denne tilnærmingen seletøy eksepsjonell svulst målretting egenskapene av antistoffer mens lister sine farmakokinetiske ulemper, og dermed redusere Stråledoser ikke mål vev og tilrettelegger for bruk av Radionuklider med halv-liv som er vurdert for kort for bruk i tradisjonelle radioimmunoconjugates. De siste fem årene, har vårt laboratorium og andre utviklet en tilnærming til i vivo pretargeting basert på inverse elektron-demand Diels-Alder (IEDDA) reaksjonen trans– cyclooctene (TCO) og tetrazine (Tz). Denne strategien har vært anvendt på pretargeted fantes et positron utslipp tomografi (PET) og enkelt-fotonet utslipp tomografi (SPECT) tenkelig med en rekke antistoff-antigen systemer. I et par nye publikasjoner, har vi vist virkningen av IEDDA-baserte PRIT i murine modeller av bukspyttkjertelen ductal adenocarcinoma og colorectal carcinoma. I denne protokollen, beskriver vi protokoller for PRIT bruker en ¹⁷⁷Lu-DOTA-merket tetrazine radioligand ([¹⁷⁷Lu] Lu-DOTA-pinne₇– Tz) og en TCO-modifisert variant av tykktarmskreft målretting huA33 antistoff (huA33-TCO). Mer spesifikt, vil vi beskrive byggingen av huA33-TCO, syntese og radiolabeling av [¹⁷⁷Lu] Lu-DOTA-pinne₇– Tz, og ytelse i vivo biodistribution og langsgående terapi studier i murine modeller av colorectal carcinoma.

Introduction

Radioimmunotherapy (RIT)-bruk av antistoffer for levering av terapeutiske Radionuklider til svulster, har lenge vært en fristende tilnærming til behandling av kreft^1,2. Faktisk dette løftet har blitt understreket av USA Food and Drug Administration godkjennelse av to radioimmunoconjugates for behandling av Non-Hodgkins lymfom: ⁹⁰Y-ibritumomab tiuxetan og ¹³¹-tositumomab^{3 , 4}. men selv fra de tidligste dagene, klinisk utsiktene til RIT blitt hemmet av en kritisk komplikasjon: høy stråling dose priser til sunt vev^5,6. Generelt radioimmunoconjugates for RIT er merket med lang levetid Radionuklider (f.eks ¹³¹jeg [t_½ = 8,0 dager] og ⁹⁰Y [t_½ = 2,7 dager]) med fysiske halv-liv som dovetail med den lenge farmakokinetiske halv-livene til immunglobuliner. Dette er viktig, som sikrer at tilstrekkelig radioaktivitet forblir når antistoffer har nådd sin optimale biodistribution etter flere dager med sirkulasjon. Men fører denne kombinasjonen av lang botid ganger i blod og lenge fysiske halv-livet uunngåelig bestråling av sunt vev, og dermed redusere terapeutiske prosenter og begrense virkningen av terapi⁷. Flere strategier utforsket for å omgå dette problemet, inkludert bruk av avkortet antistoff fragmenter som Fab, Fab’, F(ab’)₂, minibodies og nanobodies^8,9,10. En av de mest lovende og fascinerende, men unektelig komplekse, alternative tilnærminger er i vivo pretargeting¹¹.

I vivo pretargeting er en tilnærming til kjernefysiske bildebehandling og terapi som søker å utnytte utsøkte affinitet og selektivitet av antistoffer mens lister deres farmakokinetiske ulemper^11,12,13. Dette radiolabeled antistoffer brukes i tradisjonelle radioimmunotherapy er dekonstruerte i to komponenter: en lite molekyl-radioligand og en immunoconjugate som kan binde både en svulst antigen og den nevnte radioligand. Immunoconjugate er injisert første og gitt et ‘forsprang’, ofte flere dager, der det akkumuleres i vevet og tømmer fra blodet. Deretter små molekyl-radioligand administreres og kombinerer med immunoconjugate på svulst eller raskt forsvinner fra kroppen. I hovedsak avhengig i vivo pretargeting utfører radiochemistry innenfor kroppen selv. Ved å redusere sirkulasjonen av radioaktiviteten, denne tilnærmingen samtidig reduserer Stråledoser sunt vev og forenkler bruken av Radionuklider (f.eks ⁶⁸Ga, t_½ = 68 min²¹¹; Som t_½ = 7,2 h) med halv-liv som er vanligvis betraktet som uforenlig med antistoff-baserte vektorer.

Starter i slutten av 1980, en håndfull av ulike tilnærminger til i vivo pretargeting har blitt utviklet, inkludert strategier basert på bispecific antistoffer, samspillet mellom streptavidin og biotin, og hybridization av komplementære oligonucleotides^{14,15,16,17,18}. Men har hver vært holdt tilbake i varierende grad av komplikasjoner, mest kjente den potente immunogenisitet streptavidin endret antistoffer^19,20. De siste fem årene, har vår gruppe og andre utviklet en tilnærming til i vivo pretargeting basert på den rask og bioorthogonal omvendt elektron etterspørsel Diels-Alder ligation mellom trans– cyclooctene (TCO) og tetrazine (Tz) ^21,22,23,24. De mest suksessrike av disse strategiene har ansatt et TCO-endret antistoff og en Tz-bærende radioligand, som TCO er vanligvis mer stabile i vivo sin Tz partner (figur 1)^25,26. Som andre pretargeting metoder, mAb-TCO-immunoconjugate administreres først og tid å fjerne fra sirkulasjon og akkumuleres i tumor vev. Deretter injiseres små molekyl Tz radioligand, hvoretter den enten Klikk med immunoconjugate i vevet eller forsvinner raskt fra kroppen. Denne i vivo pretargeting strategi har vist seg svært effektive for PET og SPECT tenkelig med flere forskjellige antistoff/antigen systemer konsekvent produserer bilder med høy kontrast og muliggjør bruk av kortvarige Radionuklider som ¹⁸ F (t_½ = 109 min) og ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12,7 h)^21,22,24. Effekten av Klikk-baserte pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) har nylig vist i murine modeller av bukspyttkjertelen ductal adenocarcinoma (PDAC) og colorectal karsinom^27,28. For dette formål, terapeutiske radionuklidenes ¹⁷⁷Lu (β_Maks = 498 keV, t_1/2 = 6,7 dager) var ansatt sammen med to forskjellige antistoffer: 5B1, som mål karbohydrater antigen 19,9 (CA19.9) overalt uttrykt i PDAC , og huA33, som er målrettet mot A33, en transmembrane glykoprotein uttrykt i > 95% av kolorektal kreft. I begge tilfeller denne tilnærmingen til ¹⁷⁷Lu-PRIT gitt høy aktivitet konsentrasjonene i tumor vev, opprettet en doseavhengig terapeutisk effekt, og samtidig redusert aktivitet konsentrasjonene i sunt vev sammenlignet med tradisjonelle direkte-merket radioimmunoconjugates.

I denne artikkelen beskriver vi protokoller for PRIT bruker en ¹⁷⁷Lu-DOTA-merket tetrazine radioligand ([¹⁷⁷Lu] Lu-DOTA-pinne₇– Tz) og en TCO-modifisert variant av huA33 antistoffer (huA33-TCO). Mer spesifikt, beskriver vi byggingen av huA33-TCO (figur 2), syntese og radiolabeling av [¹⁷⁷Lu] Lu-DOTA-pinne₇– Tz (Figur 3 og Figur 4), og ytelse i vivo biodistribution og langsgående terapi studier i murine modeller av colorectal carcinoma. Videre i representant resultater og diskusjon, vi presentere data Prøvesett adressen mulig strategier for optimalisering av denne tilnærmingen, og vurdere denne strategien i den større sammenhengen i vivo pretargeting og PRIT. Endelig er det viktig å merke seg at mens vi har valgt å fokusere på pretargeting ved hjelp av huA33-TCO og [¹⁷⁷Lu] Lu-DOTA-pinne₇– Tz i denne protokollen, denne strategien er svært modulær og kan bli tilpasset et bredt spekter av antistoffer og Radionuklider.

Protocol

Alle i vivo dyreforsøk beskrevet i dette arbeidet ble utført i henhold til godkjente protokoller og utføres under etiske retningslinjer av Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center og Hunter College Institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteer (IACUC). 1. utarbeidelsen av huA33-TCO Merk: Syntese av huA33-TCO har vært tidligere rapporterte29. Men for enkel leseren, blir den replisert her med justeringer for…

Representative Results

Bøyning av TCO til huA33 forutsetter at koblingen mellom Amin-reaktive TCO-NHS og lysin rester på overflaten av immunglobulin. Denne metoden er svært robust og reproduserbar og gir pålitelig en grad av-typen av 2-4 TCO/mAb. I dette tilfellet var MALDI-ToF massespektrometri ansatt å bekrefte en grad av merking av ca 4.0 TCO/mAb; en lignende verdi ble oppnådd med et fluorophore-modifisert tetrazine som en reporter24. Syntese av tetrazine ligand er utført i tre…

Discussion

En av styrkene til denne tilnærmingen til i vivo pretargeting, særlig når det gjelder strategier avhenger bispecific antistoffer og radiolabeled kan, er dens Modularitet: trans– cyclooctene moieties kan legges til noen antistoff, og tetrazine radioligands kan være radiolabeled med et ekstraordinært utvalg av Radionuklider uten å svekke deres evne til å reagere med Klikk partnerne. Likevel er tilpasningen av denne tilnærmingen til andre antistoff/antigen-systemet ikke så enkelt som å duplisere …

Materials

(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS)	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS)	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN)	Fisher Scientific	A998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc)	Fisher Scientific	A639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol)	Sigma-Aldrich	70023	Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM)	Fisher Scientific	D143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Fisher Scientific	D12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit	Fisher Scientific	UFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns	Fisher Scientific	45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous	Fisher Scientific	AC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	70-011-044	10x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTA	Macrocyclics	B-205	Store at -20 °C
Triethylamine (TEA)	Fisher Scientific	AC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA)	Fisher Scientific	A116-50
Tumor measuring device	Peira TM900	Peira TM900