Pretargeted radioimmunoterapi baserat på den inversa Electron efterfråge Diels-Alder reaktionen
Summary
Det här protokollet beskriver syntes och karakterisering av en trans– cyclooctene (TCO)-den antikropp och en 177Lu-märkt tetrazine (Tz) radioligand för pretargeted radioimmunoterapi (PRIT). Dessutom specificerar det användning av dessa två konstruktioner för i vivo biodistribution och longitudinella studier i en murin modell av kolorektal cancer.
Abstract
Radioimmunoterapi (RIT) är en lovande strategi för behandling av cancer, kan den långa farmakokinetiska halveringstiden av radiomärkt antikroppar resultera i höga stråldoser till friska vävnader. Kanske inte helt överraskande, har flera olika strategier utvecklats för att kringgå denna oroande begränsning. En av de mest lovande av dessa metoder är pretargeted radioimmunoterapi (PRIT). PRIT bygger på frikoppling radionukliden från immunglobulin, injicera dem separat och sedan låter dem att kombinera i vivo på målvävnaden. Denna strategi utnyttjar de exceptionella tumör-inriktning egenskaperna av antikroppar medan lister deras farmakokinetiska nackdelar, därmed sänka stråldoser till målarter vävnader och underlätta användningen av radionuklider med halveringstider som är anses vara för kort för användning i traditionella radioimmunoconjugates. De senaste fem åren har har vårt laboratorium och andra utvecklat en strategi att i vivo pretargeting baserat på omvänd elektron-efterfrågan Diels-Alder (IEDDA) reaktionen mellan trans– cyclooctene (TCO) och tetrazine (Tz). Denna strategi har tillämpats framgångsrikt på pretargeted positron emissions tomografi (PET) och single-photon utsläpp datortomografi (SPECT) imaging med en mängd antikropp-antigen system. I ett par av de senaste publikationerna, har vi visat effekten av IEDDA-baserade PRIT i murina modeller av pankreas duktal adenokarcinom och kolorektal carcinom. I detta protokoll, beskriver vi protokoll för PRIT använder en 177Lu-DOTA-märkt tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz) och en TCO-modifierad variant av kolorektal cancer inriktning huA33 antikropp (huA33-TCO). Mer specifikt kommer vi att beskriva byggandet av huA33-TCO, syntes och radiolabeling [177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz, och prestanda i vivo biodistribution och longitudinella studier i murina modeller av kolorektal cancer.
Introduction
Radioimmunoterapi (RIT) — användning av antikroppar för leverans av terapeutiska radionuklider till tumörer — har länge varit en lockande strategi för behandling av cancer1,2. Faktiskt, detta löfte har varit ministerkvartetten United States Food and Drug Administration godkännande av två radioimmunoconjugates för behandling av Non-Hodgkins lymfom: 90Y-ibritumomab tiuxetan och 131-tositumomab3 , 4. men även från dess tidigaste dagar, kliniska utsikterna för RIT har hämmats av en kritisk komplikation: hög strålning dosrater till friska vävnader5,6. Generellt sett radioimmunoconjugates för RIT är märkta med långlivade radionuklider (t.ex. 131jag [t½ = 8,0 dagar] och 90Y [t½ = 2,7 dagar]) med fysiska halveringstider som sammanfaller väl med den långa farmakokinetiska halveringstider av immunglobuliner. Detta är viktigt, eftersom det säkerställer att tillräcklig radioaktivitet förblir när antikroppen har nått sin optimala biodistribution efter flera dagar av cirkulation. Dock resulterar denna kombination av lång residence gånger i blod och länge fysikaliska halveringstider oundvikligen i bestrålning av friska vävnader, därmed minska terapeutiska nyckeltal och begränsar effekten av terapi7. Flera strategier har utforskats för att kringgå detta problem, inklusive användning av trunkerade antikroppsfragment som Fab, Fab’, F(ab’)2, minibodies och nanobodies8,9,10. Det är en av de mest lovande och fascinerande ändå onekligen komplexa, alternativa metoder i vivo pretargeting11.
In vivo pretargeting är ett förhållningssätt till Kärn avbildning och terapi som syftar till att utnyttja den utsökta affinitet och selektivitet av antikroppar medan lister deras farmakokinetiska nackdelar11,12,13. Därför är det radioaktivt märkt antikropp som används i traditionella radioimmunoterapi dekonstrueras i två komponenter: en liten molekyl radioligand och en immunoconjugate som kan binda både en tumör antigen och den ovannämnda radioligand. Immunoconjugate är injiceras först och gett en ‘head start’, ofta flera dagar, under vilken det ackumuleras i målvävnaden och rensar från blodet. Därefter, den liten molekyl radioligand administreras och kombinerar med immunoconjugate på tumören eller snabbt försvinner från kroppen. I huvudsak åberopat i vivo pretargeting utför radiokemi inom kroppen själv. Genom att minska cirkulationen av radioaktiviteten, detta tillvägagångssätt samtidigt minskar stråldoser till friska vävnader och underlättar användningen av radionuklider (t.ex. 68Ga, t½ = 68 min211; Som, t½ = 7,2 h) med halveringstider som vanligtvis anses oförenligt med antikroppsbaserade vektorer.
Start i slutet av 1980, en handfull olika förhållningssätt till i vivo pretargeting har utarbetats, inklusive strategier baserade på bispecific antikroppar, samspelet mellan streptividin och biotin, och hybridisering av kompletterande oligonukleotider14,15,16,17,18. Ännu har var hållits tillbaka till varierande grad av komplikationer, mest bekant potent immunogeniciteten hos streptividin-modifierade antikroppar19,20. De senaste fem åren, har vår grupp och andra utvecklat en strategi att i vivo pretargeting baserat på den snabba och bioorthogonal omvänd elektron efterfrågan Diels-Alder ligering mellan trans– cyclooctene (TCO) och tetrazine (Tz) 21,22,23,24. Den mest framgångsrika av dessa strategier har anställt en TCO-modifierade antikropp och en Tz-bärande radioligand, som TCO är vanligtvis stabilare i vivo än dess Tz partner (figur 1)25,26. Liksom andra pretargeting metoder, är den mAb-TCO immunoconjugate administreras först och ges tid att rensa från cirkulationen och ackumuleras i tumörvävnad. Därefter sprutas den liten molekyl Tz radioligand, varefter den klick med immunoconjugate inom målvävnaden eller rensar snabbt från kroppen. Här i vivo pretargeting strategi har visat sig mycket effektiv för PET och SPECT imaging med flera olika antikropp/antigen system, konsekvent producera bilder med hög kontrast och möjliggör användning av kortlivade radionuklider såsom 18 F (t½ = 109 min) och 64Cu (t1/2 = 12,7 h)21,22,24. Effekten av Klicka-baserade pretargeted radioimmunoterapi (PRIT) har nyligen visats i murina modeller av pankreas duktal adenokarcinom (PDAC) och kolorektal carcinom27,28. För detta ändamål, den terapeutiska radionuklid 177Lu (βmax = 498 keV, t1/2 = 6,7 dagar) var anställd i samband med två olika antikroppar: 5B1, som riktar sig till kolhydrater antigen 19,9 (CA19.9) ubiquitously uttryckt i PDAC , och huA33, som riktar A33, en transmembrana glykoprotein uttryckt i > 95% av kolorektal cancer. I båda fallen detta tillvägagångssätt till 177Lu-PRIT gav hög aktivitetskoncentrationer i tumörvävnad, skapat en dosberoende terapeutiska effekt och samtidigt minskat aktivitetskoncentrationer i friska vävnader jämfört med traditionella direkt-märkt radioimmunoconjugates.
I den här artikeln beskriver vi protokoll för PRIT använder en 177Lu-DOTA-märkt tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz) och en TCO-modifierad variant av huA33 antikropp (huA33-TCO). Mer specifikt beskriver vi byggandet av huA33-TCO (figur 2), syntes och radiolabeling [177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz (figur 3 och figur 4) och prestanda i vivo biodistribution och longitudinella studier i murina modeller av kolorektal cancer. Dessutom i den representativa resultat och diskussion, vi presenterar ett prov data set, adress möjliga strategier för optimering av denna strategi, och överväga denna strategi i ett större sammanhang i vivo pretargeting och PRIT. Slutligen är det viktigt att notera att medan vi har valt att fokusera på pretargeting med huA33-TCO och [177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz i detta protokoll, denna strategi är mycket modulärt och kan anpassas för att passa ett brett spektrum av antikroppar och radionuklider.
Protocol
Representative Results
Discussion
En av styrkorna i detta förhållningssätt till i vivo pretargeting — särskilt när det gäller strategier bygger på bispecific antikroppar och radioaktivt haptener — är dess modularitet: trans– cyclooctene beståndsdelarna kan läggas till någon antikropp, och tetrazine radioligands kan vara märkt med en extra mängd radionuklider utan att försämra deras förmåga att reagera med deras Klicka partners. Anpassning av detta förhållningssätt till andra antikropp/antigen-systemet är ännu i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr Jacob Houghton för bra konversationer. Författarna vill även tacka NIH för sin generösa finansiering (R00CA178205 och U01CA221046).
Materials
| (E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) | Sigma-Aldrich | 764523 | Store at -80 °C |
| 2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) | Sigma-Aldrich | 764701 | Store at -80 °C |
| Acetonitrile (MeCN) | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Ammonium Acetate (NH4OAc) | Fisher Scientific | A639-500 | |
| Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 70023 | Store at -20 °C |
| Dichloromethane (DCM) | Fisher Scientific | D143-1 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous | Fisher Scientific | D12345 | |
| EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | Fisher Scientific | UFC205024 | |
| GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous | Fisher Scientific | AC610941000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 70-011-044 | 10x Concentrated |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -20 °C |
| Triethylamine (TEA) | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | A116-50 | |
| Tumor measuring device | Peira TM900 | Peira TM900 |
Referências
- Goldenberg, D. M. Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies. Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).
- Goldenberg, D. M., et al. Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Antibody. Journal of Clinical Oncology. 9 (4), 548-564 (1991).
- Kaminski, M. S., et al. Radioimmunotherapy with 131I-Tositumomab for Relapsed or Refractory B-cell non-Hodgkin Lymphoma: Updated Results and Long-Term Follow-Up of the University of Michigan Experience. Blood. 96 (4), 1259-1266 (2000).
- Davies, A. J. Radioimmunotherapy for B-cell Lymphoma: Y90 Ibritumomab Tiuxetan and I131 Tositumomab. Oncogene. 26, 3614 (2007).
- Rajendran, J., et al. Comparison of Radiation Dose Estimation for Myeloablative Radioimmunotherapy for Relapsed or Recurrent Mantle Cell Lymphoma Using 131I Tositumomab to That of Other Types of Non-Hodgkin’s Lymphoma. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 19 (6), 738-745 (2004).
- Rajendran, J. G., et al. High-Dose 131I-Tositumomab (Anti-CD20) Radioimmunotherapy for Non-Hodgkin’s Lymphoma: Adjusting Radiation Absorbed Dose to Actual Organ Volumes. Journal of Nuclear Medicine. 45 (6), 1059-1064 (2004).
- Larson, S. M., Carrasquillo, J. A., Cheung, N. -. K. V., Press, O. Radioimmunotherapy of Human tumours. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 347-360 (2015).
- Kelly, M. P., et al. Tumor Targeting by a Multivalent Single-Chain Fv (scFv) Anti-Lewis Y Antibody Construct. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 23 (4), 411-423 (2008).
- Yazaki, P. J., et al. Tumor Targeting of Radiometal Labeled Anti-CEA Recombinant T84.66 Diabody and T84.66 Minibody: Comparison to Radioiodinated Fragments. Bioconjugate Chemistry. 12 (2), 220-228 (2001).
- van Duijnhoven, S. M. J., et al. Diabody Pretargeting with Click Chemistry In Vivo. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1422-1428 (2015).
- Altai, M., Membreno, R., Cook, B., Tolmachev, V., Zeglis, B. M. Pretargeted Imaging and Therapy. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1553-1559 (2017).
- Goldenberg, D. M., Chatal, J. -. F., Barbet, J., Boerman, O., Sharkey, R. M. Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting. Update on cancer therapeutics. 2 (1), 19-31 (2007).
- Rossin, R., et al. In-Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angewandte Chemie International Edition. 49 (19), 3375-3378 (2010).
- Gestin, J. F., et al. Two-Step Targeting of Xenografted Colon Carcinoma Using a Bispecific Antibody and 188Re-Labeled Bivalent Hapten: Biodistribution and Dosimetry Studies. Journal of Nuclear Medicine. 42 (1), 146-153 (2001).
- Green, D. J., et al. Comparative Analysis of Bispecific Antibody and Streptavidin-Targeted Radioimmunotherapy for B-cell Cancers. Pesquisa do Câncer. 76 (22), 6669 (2016).
- Sharkey, R. M., et al. Development of a Streptavidin−Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody, Radiolabeled Biotin Pretargeting Method for Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer. Studies in a Human Colon Cancer Xenograft Model. Bioconjugate Chemistry. 8 (4), 595-604 (1997).
- Knox, S. J., et al. Phase II Trial of Yttrium-90-DOTA-Biotin Pretargeted by NR-LU-10 Antibody/Streptavidin in Patients with Metastatic Colon Cancer. Clinical Cancer Research. 6 (2), 406 (2000).
- Schubert, M., et al. Novel Tumor Pretargeting System Based on Complementary L-Configured Oligonucleotides. Bioconjugate Chemistry. 28 (4), 1176-1188 (2017).
- Forero, A., et al. Phase 1 Trial of a Novel Anti-CD20 Fusion Protein in Pretargeted Radioimmunotherapy for B-cell Non-Hodgkin Lymphoma. Blood. 104 (1), 227 (2004).
- Kalofonos, H. P., et al. Imaging of Tumor in Patients with Indium-111-Labeled Biotin and Streptavidin-Conjugated Antibodies: Preliminary Communication. Journal of Nuclear Medicine. 31 (11), 1791-1796 (1990).
- Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54 (8), 1389-1396 (2013).
- Meyer, J. -. P., et al. 18F-Based Pretargeted PET Imaging Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 27 (2), 298-301 (2016).
- Rossin, R., Läppchen, T., vanden Bosch, S. M., Laforest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder Reaction for Tumor Pretargeting: In Vivo Chemistry Can Boost Tumor Radiation Dose Compared with Directly Labeled Antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54 (11), 1989-1995 (2013).
- Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Molecular Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide−Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. Journal of the American Chemical Society. 126 (46), 15046-15047 (2004).
- Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels−Alder Reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130 (41), 13518-13519 (2008).
- Houghton, J. L., et al. Establishment of the In Vivo Efficacy of Pretargeted Radioimmunotherapy Utilizing Inverse Electron Demand Diels-Alder Click Chemistry. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (1), 124-133 (2017).
- Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Carcinoma. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018).
- Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. Journal of Visualized Experiments. (96), e52335 (2015).
- Cook, B. E., Membreno, R., Zeglis, B. M. Dendrimer Scaffold for the Amplification of In Vivo Pretargeting Ligations. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2734-2740 (2018).
- Cheal, S. M., et al. Theranostic Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer Xenografts in Mice Using Picomolar Affinity Y-86- or Lu-177-DOTA-Bn Binding scFv C825/GPA33 IgG Bispecific Immunoconjugates. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 43 (5), 925-937 (2016).
- Meyer, J. -. P., et al. Bioorthogonal Masking of Circulating Antibody-TCO Groups Using Tetrazine-Functionalized Dextran Polymers. Bioconjugate Chemistry. 29 (2), 538-545 (2018).
- Houghton, J. L., et al. Pretargeted Immuno-PET of Pancreatic Cancer: Overcoming Circulating Antigen and Internalized Antibody to Reduce Radiation Doses. Journal of Nuclear Medicine. 57 (3), 453-459 (2016).
- Keinänen, O., et al. Pretargeting of Internalizing Trastuzumab and Cetuximab with a (18)F-Tetrazine Tracer in Xenograft Models. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Research. 7, 95 (2017).
- Billaud, E. M. F., et al. Micro-flow Photosynthesis of New Dienophiles for Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactions. Potential Applications for Pretargeted In Vivo PET Imaging. Chemical Science. 8 (2), 1251-1258 (2017).
