En simpel Migration/Invasion arbejdsgang ved hjælp af en automatiseret Live-celle Imager
Summary
Den nuværende protokol beskriver en integreret metode undersøger kræft celle migration og invasion på en enkelt platform i realtid, som giver en let gengivelig og tid-effektiv mulighed for at studere cellen mobilitet og morfologi.
Abstract
Kræft celle mobilitet er afgørende for indledningen af metastaser. Undersøgelse af celle bevægelse og invasive kapacitet er derfor af stor betydning. Migration assays give grundlæggende indsigt i celle bevægelse på en 2D plan, mens invasion assays er mere fysiologisk relevante, efterligne in vivo kræft celle dislodgment fra det oprindelige websted og invaderer gennem den ekstracellulære matrix. Den nuværende protokol giver en enkelt arbejdsgang for migration og invasion assays. Sammen med den integrerede automatiseret mikroskopiske kamera for real-time HD billeder og indbygget analyse modul giver det forskerne en tid-effektiv, simpel og reproducerbar eksperimentelle indstilling. Denne protokol omfatter også erstatninger for forbrugsstoffer og alternative analysemetoder for brugere at vælge imellem.
Introduction
Celle migration og invasion er vigtige biologiske processer, der aktiverer normale funktioner i det menneskelige legeme, såsom sår lukning, invasion af moderkagen i livmoderen og mælkekirtlen morfogenese1,2,3. Den menneskelige krop har præcise og nøje kontrol af disse biologiske hændelser; der er dog nogle undtagelser. Maligne tumorer, for eksempel, er stand til at undslippe denne sikkerhedsforanstaltning, udstille unormale spredning og invadere i omkringliggende væv, som kaldes metastaser. Metastaser er den største årsag til cancer-relaterede dødelighed4.
Brystkræft er mest almindeligt diagnosticeret kræft hos kvinder, og er den næsthøjeste årsag til cancer-relaterede dødsfald blandt kvinder i udviklede lande verden over5. Brystkræft stammer fra kanalerne eller lobules, der består af et eller flere lag af epitelceller. I den normale bryst overholde epitelceller hinanden og basalmembranen gennem Membranproteiner som E-cadherin og integriner6. Men invasiv brystkræftceller har mistet deres polaritet og cell-celle vedhæftning, og klassisk gennemgå epitelial mesenchymale overgang (EMT) og få mulighed for at flytte. Efter ekstravasation, disse celler flytte på tværs af den ekstracellulære matrix (ECM) og indtaste blodkar eller lymfesystemet, derefter efterfulgt af intravasation og metastatisk vækst7. Forstå de mekanismer, hvormed dette sker er af stor betydning, fordi metastase er den mest almindelige årsag til cancer-relaterede dødelighed og er nært beslægtet med kræft celle migration/invasion. For at visualisere bevægelse af kræftceller, er migration og invasion assays ideelle modeller at studere 2D og 3D celle bevægelse, henholdsvis. Migration vurderer direkte bevægelse af cellerne invasion indebærer interaktion med mikromiljø og evnen til at forringe biologiske barrierer. De to processer er ikke fuldstændig uafhængigt af hinanden, som migration er et krav for en invasion.
Flere metoder er blevet udviklet for at studere migration og invasion. Som gennemgået af Kramer et al., migration assays såsom sårheling, genererer hegn og mikro-carrier assays en celle-fri område at tillade celler til at flytte ind, vurdering af ændringen af område; transwell og kapillær assays er baseret på antallet af celler, der bevæger sig mod en attractant8. For invasion assays, en ECM miljø skal sættes op med ECM gel eller kollagen for eksempel, og 3D bevægelse kan vurderes ved at overvåge invasion område, afstand og celle tæller (f.eks. transwell assay, platypus assay)8. En anden type af invasion assay er at kombinere de invasive celler med non-invasiv celler og vurdere adfærd af de invasive celler (f.eks. klumpformet undersøgelser). Ovenstående metoder har deres fordele og ulemper, og en måde, der er let at tilgang, let at gentage og kombinere migration analysen og invasion assay i en lignende arbejdsproces er privilegerede i eksperimentelle design.
Denne protokol beskriver måling af celle migration og invasion ved hjælp af en live-celle imager. Det er en real-time celle overvågnings system installeret i en standard celle kultur inkubator. Det tager high definition billeder ifølge sæt scanning intervaller og målinger ved at anvende passende masker på celler eller fluorescerende mål. Modul af migration/invasion assay omfatter også brug af en 96-pin skrabeværktøj, som er egnet til at gøre homogene scratch sår på en celle éncellelag i en 96-brønd plade. Mekanismen er baseret på in vitro-sår healing assays, overvågning 2D celle bevægelse på en plastik eller coated overflade. Invasion eller 3D bevægelse på tværs af en yderligere ECM i bunden sår kan også blive vurderet. En kort workflow er illustreret i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Migration og invasion er vigtige parametre til at vurdere mobilitet af kræftceller. Ved hjælp af værktøjet 96-pin scratch, er det muligt at gennemføre sårheling assays i 2D og 3D samtidigt. Ud over at lette den automatiske scanning giver en stabil celle kultur miljø med minimal forstyrrelse, scratch analysen foretaget ved hjælp af værktøjet 96-pin scratch giver konsekvent scratch sår, gør det muligt for eksperimenter, der er mere robuste og reproducerbare. 96-brønd plade format giver ekstra muligheder for en…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne anerkende vores finansielle støtte af Bloomfield gruppe Foundation gennem Hunter Medical Research Institute (HMRI 13-02). X.Z understøttes af en APA stipendium gennem University of Newcastle og HCRA biomarkører flagskib ph.d.-stipendium.
Materials
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
Referências
- Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10, 683-690 (2014).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. Breast cancer metastasis. Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
