स्वचालित लाइव-सेल Imager का उपयोग करके एक साधारण माइग्रेशन/
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल वास्तविक समय में एक ही मंच पर कैंसर सेल प्रवास और आक्रमण की जांच एक एकीकृत विधि का वर्णन करता है, एक आसानी से reproducible और समय कुशल सेल गतिशीलता और आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए विकल्प प्रदान करते हैं ।
Abstract
कैंसर कोशिका गतिशीलता मेटास्टेसिस की दीक्षा के लिए महत्वपूर्ण है । इसलिए, सेल आंदोलन और इनवेसिव क्षमता की जांच बहुत महत्व की है । प्रवास परख एक 2d स्तर पर सेल आंदोलन के बुनियादी अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, जबकि आक्रमण परख और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं, मूल साइट से vivo कैंसर सेल विज्ञान में नकल उतार और extracellular मैट्रिक्स के माध्यम से हमला । वर्तमान प्रोटोकॉल माइग्रेशन और आक्रमण की परख के लिए एक एकल कार्यप्रवाह प्रदान करता है । साथ में वास्तविक समय HD छवियों और निर्मित विश्लेषण मॉड्यूल के लिए एकीकृत स्वचालित माइक्रोस्कोपी कैमरा के साथ, यह शोधकर्ताओं एक समय कुशल, सरल और reproducible प्रयोगात्मक विकल्प देता है. इस प्रोटोकॉल में उपभोग्य सामग्रियों और उपयोगकर्ताओं के लिए वैकल्पिक विश्लेषण विधियों में से चुनने के लिए प्रतिस्थापन भी शामिल हैं ।
Introduction
सेल प्रवास और आक्रमण महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं है कि मानव शरीर में सामान्य कार्यों, जैसे कि घाव बंद करने, गर्भाशय और स्तन ग्रंथि morphogenesis1,2,3में अपरा के आक्रमण को सक्षम कर रहे हैं । मानव शरीर इन जैविक घटनाओं का सटीक और सख्त नियंत्रण है; हालांकि, कुछ अपवाद हैं । घातक ट्यूमर, उदाहरण के लिए, इस रक्षा, प्रदर्शन असामान्य प्रसार से बचने और पड़ोसी ऊतक, जो मेटास्टेसिस कहा जाता है में आक्रमण करने में सक्षम हैं । मेटास्टेसिस कैंसर से संबंधित मृत्युदर4का प्रमुख कारण है ।
स्तन कैंसर महिलाओं में सबसे अधिक निदान कैंसर है, और दुनिया भर में विकसित देशों में5महिलाओं के बीच कैंसर से संबंधित मौत का दूसरा सबसे अधिक कारण है । स्तन कैंसर नलिकाओं या खण्डों है कि उपकला कोशिकाओं की एक या एक से अधिक परतों से मिलकर बनता है । सामान्य स्तन में, उपकला कोशिकाओं को एक दूसरे के लिए और इस तरह के ई-cadherin और integrins6के रूप में झिल्ली प्रोटीन के माध्यम से तहखाने झिल्ली का पालन. हालांकि, आक्रामक स्तन कैंसर की कोशिकाओं को उनके ध्रुवीकरण और सेल-सेल आसंजन खो दिया है, और क्लासिकल उपकला mesenchymal संक्रमण (EMT) से गुजरना और स्थानांतरित करने की क्षमता हासिल । extravasation के बाद, इन कोशिकाओं extracellular मैट्रिक्स भर में कदम (ECM) और रक्त वाहिका या लसीका प्रणाली में प्रवेश, तो intravasation और मेटास्टेटिक विकास7द्वारा पीछा किया । तंत्र को समझना जिसके द्वारा यह बहुत महत्व का होता है, क्योंकि मेटास्टेसिस कैंसर से संबंधित मृत्यु का सबसे आम कारण है और निकट कैंसर सेल प्रवास के लिए संबंधित/ कैंसर की कोशिकाओं, प्रवास और आक्रमण परख के आंदोलन कल्पना करने के लिए आदर्श 2d और 3 डी सेल आंदोलन, क्रमशः अध्ययन मॉडल हैं । प्रवासन सीधे आक्रमण जबकि कोशिकाओं के आंदोलन का आकलन microenvironment और जैविक बाधाओं नीचा करने की क्षमता के साथ बातचीत शामिल है । दो प्रक्रियाओं को एक दूसरे के पूरी तरह से स्वतंत्र नहीं हैं, के रूप में प्रवास के आक्रमण की आवश्यकता है ।
प्रवास और आक्रमण का अध्ययन करने के लिए कई विधियां विकसित की गई हैं । के रूप में क्रेमर एट अल द्वारा समीक्षित., इस तरह के घाव हीलिंग, बाड़ और सूक्ष्म वाहक परख के रूप में प्रवास परख एक सेल मुक्त क्षेत्र के लिए कोशिकाओं में स्थानांतरित करने की अनुमति, क्षेत्र के परिवर्तन का आकलन उत्पंन; जबकि, transwell और केशिका परख कोशिकाओं है कि एक आकर्षित8की ओर कदम की संख्या पर आधारित हैं । आक्रमण की परख के लिए, एक ECM पर्यावरण के लिए ECM जेल या कोलेजन के साथ उदाहरण के लिए स्थापित किया जाना है, और 3 डी आंदोलन आक्रमण क्षेत्र, दूरी और कोशिका गिनती (जैसे transwell परख, platypus परख)8निगरानी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । आक्रमण परख का एक अंय प्रकार के लिए गैर इनवेसिव कोशिकाओं के साथ आक्रामक कोशिकाओं गठबंधन और इनवेसिव कोशिकाओं के व्यवहार का आकलन है (अंडाकार आकृति परख) । इसके बाद के संस्करण तरीकों उनके पेशेवरों और बुरा है, और एक तरीका है कि दृष्टिकोण आसान है, को दोहराना आसान है, और एक समान कार्यप्रवाह में प्रवास परख और आक्रमण परख गठबंधन प्रयोगात्मक डिजाइन में तरजीह है ।
इस प्रोटोकॉल एक जीवित सेल imager का उपयोग कर सेल प्रवास और आक्रमण की माप का वर्णन । यह एक वास्तविक समय सेल निगरानी प्रणाली एक मानक सेल संस्कृति मशीन में स्थापित है । यह कोशिकाओं या फ्लोरोसेंट लक्ष्य के लिए उपयुक्त मास्क लगाने के द्वारा सेट स्कैनिंग अंतराल और माप के अनुसार उच्च परिभाषा छवियों लेता है । प्रवास के मॉड्यूल/आक्रमण परख एक ९६-पिन खरोंच उपकरण है, जो एक ९६-अच्छी तरह से थाली में एक सेल monolayer पर सजातीय खरोंच बनाने के लिए उपयुक्त है का उपयोग भी शामिल है । तंत्र इन विट्रो घाव हीलिंग परख, एक प्लास्टिक या लेपित सतह पर 2 डी सेल आंदोलन की निगरानी पर आधारित है । आक्रमण या खरोंच घाव के भीतर एक अतिरिक्त ECM भर में 3 डी आंदोलन भी मूल्यांकन किया जा सकता है । चित्रा 1में एक संक्षिप्त कार्यप्रवाह सचित्र है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
माइग्रेशन और आक्रमण कैंसर कोशिकाओं की गतिशीलता का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं । ९६-पिन खरोंच उपकरण का उपयोग करके, यह एक साथ 2d और 3 डी में घाव हीलिंग परख आचरण करने के लिए संभव है । इसके अलावा स?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम हंटर चिकित्सा अनुसंधान संस्थान (HMRI 13-02) के माध्यम से Bloomfield समूह फाउंडेशन द्वारा हमारे धन का समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं । X. Z न्यूकैसल विश्वविद्यालय और HCRA के माध्यम से एक आपा छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है मार्क्स प्रमुख पीएचडी छात्रवृत्ति ।
Materials
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
Referências
- Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10, 683-690 (2014).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. Breast cancer metastasis. Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
