Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı
Summary
Geçerli protokol kanser hücre göç ve gerçek zamanlı olarak tek bir platformda işgali araştırma, kolayca tekrarlanabilir ve zamanı verimli bir seçenek hücre hareketlilik ve morfoloji çalışmaya sağlayan entegre bir yöntemini açıklar.
Abstract
Kanser hücre hareketlilik metastaz kabul töreni için önemlidir. Bu nedenle, araştırma hücre hareket ve invaziv kapasitesi büyük önem taşıyor. İstila deneyleri içinde vivo kanser hücre dislodgment Orijinal siteden taklit ve hücre dışı matriks ile işgal daha fizyolojik alakalı ise geçiş deneyleri 2D bir düzeyde hücre hareketinin temel anlayış sağlar. Geçerli protokol geçişi ve işgal deneyleri için tek bir iş akışı sağlar. Entegre otomatik mikroskobik kamera ile birlikte gerçek zamanlı HD görüntüleri ve yerleşik analizi modülü için araştırmacılar bir zaman verimli, basit ve tekrarlanabilir deneysel seçeneği verir. Bu protokol sarf malzemeleri için oyuncu değişikliği ve alternatif analiz yöntemleri seçmek kullanıcılar için de içerir.
Introduction
Hücre göç ve işgal yara kapatma, plasenta rahim ve meme bezi morfogenez1,2,3içine işgali gibi insan vücudu normal işlevlerini etkinleştirmek önemli biyolojik işlemlerdir. İnsan vücudu bu biyolojik olayların hassas ve sıkı denetime sahip; Ancak, bazı istisnalar vardır. Malign tümörler, örneğin, bu korumayı kaçmak, anormal proliferasyonu sergi ve metastaz denir komşu doku istila edebiliyoruz. Metastaz kanserle ilgili mortalite4önemli nedenidir.
Meme kanseri en sık kadınlarda kanser tanısı ve gelişmiş ülkelerde dünya çapında5‘ kadınlar arasında kanser ile ilgili ölüm ikinci en yüksek nedeni var. Meme kanseri kanalları veya epitel hücrelerinin bir veya daha fazla kat oluşur lobules gelmektedir. Normal meme, epitel hücreleri birbirleriyle ve üzerinden E-cadherin ve integrinler6gibi membran proteinlerinin membran uygun. Ancak, invaziv meme kanseri hücrelerinin kendi Polarite ve hücre-hücre adezyon, kaybetmiş ve klasik epitel mezenkimal geçiş (EMT) geçmesi ve taşıma becerisi kazanırsınız. Ekstravazasyonu sonra bu hücreler hücre dışı matriks (ECM) gidin ve kan damarı veya lenfatik sistem, o zaman ardından intravasation ve metastatik büyüme7girin. Bu oluştuğu tarafından mekanizmaları anlama büyük önem taşıyor, metastaz Scotlan kanserle ilgili en sık nedenidir ve kanseri ile yakından ilgili geçiş/işgali hücre. Kanser hücrelerinin hareket görselleştirmek için göç ve işgal deneyleri hücre hareketi, 2D ve 3D sırasıyla eğitim için ideal modellerdir. İstila microenvironment ve biyolojik engelleri aşağılamak yeteneği ile etkileşimi içerir, ancak geçiş hücreleri hareket doğrudan değerlendiriyor. Geçiş işgalinin bir gereklilik olduğu gibi iki süreç bir başka tamamen bağımsız değildir.
Göç ve işgal çalışmaya çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Tarafından Kramer ve ark., yara iyileşmesi gibi geçiş deneyleri gözden olarak çit ve mikro-taşıyıcı deneyleri alan değişikliği değerlendiren hücreleri içine, taşımak izin vermek için bir boş hücre alanı oluşturmak; Oysa, transwell ve kılcal deneyleri cezbedici8doğru hareket hücreleri temel alır. İstila deneyleri için bir ECM ortam ECM jel veya kollajen ile örneğin ayarlanması gerekiyor ve 3D hareket değerlendirildi işgal alanı, mesafe ve hücre sayımları (örneğin transwell tahlil, platypus tahlil) izleyerek8. Başka bir istila tahlil non-invaziv hücreleri ile invaziv hücreleri birleştirmek ve invaziv hücreleri davranışını değerlendirmek için türüdür (örneğin küresel deneyleri). Belgili tanımlık yukarıda yöntem kendi artılarını ve eksilerini ve yaklaşım, tekrar ve geçiş tahlil birleştirmek kolay kolay bir şekilde ve işgal tahlil benzer iş akışında deneysel tasarım Tercihli.
Bu iletişim kuralı hücre göç ve canlı hücre Imager kullanarak işgali ölçümü açıklar. Standart hücre kültür kuluçka makinesine yüklü sistem izleme gerçek zamanlı bir hücredir. Yüksek çözünürlüklü görüntüleri tarama aralıkları ve ölçümler hücreleri veya floresan hedefler için uygun maskeleri uygulayarak kümesi göre alır. Geçiş/işgali tahlil modülü bir 96-şey tabak içinde sıfırdan yaraya homojen bir hücre monolayer yapmak için uygun bir 96-pin sıfırdan aracını kullanarak içerir. Mekanizması deneyleri şifa, bir plastik veya kaplı yüzey sadece 2D hücre hareket izleme tüp bebek yara temel alır. İşgal veya 3D hareket yara çizik içinde ek bir ECM arasında da tespit edilebilir. Kısa bir iş akışı Şekil 1‘ de gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Göç ve işgal kanser hücrelerinin hareketliliğini değerlendirmek için önemli parametreleridir. 96-pin karalama aracı kullanarak, aynı anda deneyleri 2D ve 3D şifa yara yapmak mümkündür. Otomatik tarama kolaylaştırıcı dışında en az kesinti ile istikrarlı hücre kültür ortamı sağlayarak 96-pin karalama Aracı kullanılarak yürütülen karalama tahlil daha sağlam deneyler etkinleştirme tutarlı sıfırdan yaralar sağlar ve tekrarlanabilir. 96-şey plaka biçim hücre hatları veya farklı ilaç …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bloomfield grup Vakfı aracılığıyla Hunter Tıbbi Araştırma Enstitüsü (HMRI 13-02) tarafından finansman destek kabul etmek istiyoruz. X.Z bir APA burs ile Newcastle Üniversitesi ve HCRA biyolojik amiral gemisi Doktora Bursu tarafından desteklenir.
Materials
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
Referências
- Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10, 683-690 (2014).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. Breast cancer metastasis. Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
