Eine einfache Migration/Invasion Workflow mit einer automatisierten Leben-Zelle-Imager
Summary
Das aktuelle Protokoll beschreibt eine integrierte Methode untersucht Krebs Zelle Migration und Invasion auf einer einzigen Plattform in Echtzeit und bietet eine leicht reproduzierbare und zeitsparende Option Zelle Mobilität und Morphologie.
Abstract
Krebs Zelle Mobilität ist entscheidend für die Einleitung von Metastasen. Daher ist der Zellbewegung und -invasive Untersuchung von großer Bedeutung. Migration-Assays bieten grundlegende Einsicht der Zellbewegung 2D Ebene, während Invasion Assays imitiert in-vivo Krebs Zelle Dislodgment von der ursprünglichen Website und Invasion durch die extrazelluläre Matrix mehr physiologisch relevant sind. Das aktuelle Protokoll sieht einen einheitlichen Workflow für Migration und Invasion Assays. Zusammen mit der integrierten automatischen mikroskopische Kamera für HD-Bilder in Echtzeit und integrierte Analyse-Modul gibt es Forscher eine zeitsparende, einfache und reproduzierbare experimentelle Option. Dieses Protokoll enthält auch Ersetzungen für Verbrauchsmaterialien und alternativen Analysemethoden für Benutzer zur Auswahl.
Introduction
Zelle Migration und Invasion sind wichtige biologische Prozesse, die normale Funktionen im menschlichen Körper, wie z. B. Wundverschluss, Invasion der Plazenta in der Gebärmutter und Brustdrüse Morphogenese1,2,3zu ermöglichen. Der menschliche Körper hat präzise und strenge Kontrolle dieser biologischen Ereignisse; Es gibt jedoch einige Ausnahmen. Bösartige Tumore können zum Beispiel dieses Sicherheitsmerkmal zu entgehen, weisen abnorme Proliferation und dringen in benachbarte Gewebe, die Metastasen genannt wird. Metastasierung ist die Hauptursache von Krebs-in Verbindung stehenden Sterblichkeit4.
Brustkrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebserkrankung bei Frauen, und ist die zweithöchste Todesursache krebsbedingte Todesursache bei Frauen in Industrieländern weltweit5. Brustkrebs stammt aus Leitungen oder Läppchen, die aus einer oder mehreren Schichten von epithelialen Zellen bestehen. In der normalen Brust halten Epithelzellen untereinander und der Basalmembran durch Membranproteine wie z. B. E-Cadherin und Integrine6. Jedoch invasiven Brustkrebs-Zellen ihre Polarität und Zell-Zell-Adhäsion, verloren haben und klassisch epitheliale mesenchymale Transition (EMT) zu unterziehen und die Fähigkeit erlangen, bewegen. Nach Paravasation diese Zellen bewegen sich über die extrazelluläre Matrix (ECM) und das Blutgefäß oder das lymphatische System, dann folgten Intravasation und metastasiertem Wachstum7eingeben. Das Verständnis der Mechanismen, mit denen dies geschieht, ist von großer Bedeutung, da Metastasen die häufigste Ursache von Krebs-in Verbindung stehenden Todesfälle ist und eng mit Krebs verwandt ist Zelle Migration/Invasion. Um die Bewegung von Krebszellen zu visualisieren, sind Migration und Invasion Assays ideale Modelle für 2D und 3D Zellbewegung, bzw. studieren. Migration wird die Bewegung der Zellen direkt beurteilt, Invasion erfordert Interaktion mit der Mikroumgebung und die Fähigkeit, biologische Barrieren abbauen. Die zwei Prozesse sind nicht völlig unabhängig voneinander, wie Migration eine Anforderung der Invasion ist.
Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um Migration und Invasion zu studieren. Wie von Kramer Et Al., Migration-Assays wie Wundheilung, überprüft Zaun und Mikro-Träger Assays generieren eine zellfreien Gegend um Zellen bezogen, Bewertung der Änderung des Bereichs zu ermöglichen; in der Erwägung, dass Transwell und Kapillare Assays auf die Anzahl der Zellen basieren, die auf einem Lockstoff8zu bewegen. Für Invasion Assays, eine ECM-Umgebung hat zum Beispiel mit ECM Gel oder Kollagen eingerichtet werden, und 3D Bewegung beurteilt werden kann, durch die Überwachung der Invasion Fläche, Distanz und Zelle zählt (z.B. Transwell Assay, Schnabeltiere Assay)8. Eine andere Art von Invasion Assay ist die Kombination der invasiven Zellen mit nicht-invasiven Zellen und beurteilen das Verhalten der invasiven Zellen (z. B. Sphäroid assays). Die oben genannten Methoden haben ihre vor und Nachteile und eine Weise, die leicht zugänglich, leicht zu wiederholen, und kombinieren Sie die Migration-Assay und Invasion-Assay in einem ähnlichen Workflow ist bevorzugt im experimentellen Design.
Dieses Protokoll beschreibt die Messung der Zelle Migration und Invasion mit einer live-Cell-Imager. Es ist eine Echtzeit-Zelle Überwachungssystem installiert in einem Inkubator Standardzelle Kultur. High-Definition-Bilder entsprechend den eingestellten Intervalle und Messungen durch die Anwendung geeigneter Masken der Zellen und fluoreszierende Vorgaben Scannen dauert. Das Modul der Migration/Invasion Assay umfasst mit einem 96-poligen Scratch Tool, welches zur Herstellung von homogenerer Kratzer Wunden auf eine Zelle monomolekularen Film in eine 96-Well-Platte eignet. Der Mechanismus basiert auf in-vitro-Wunde heilen Assays, Überwachung 2D Zellbewegung auf einem Kunststoff oder beschichtete Oberfläche. Invasion oder 3D Bewegung über eine zusätzliche ECM innerhalb der Kratzer, die Wunde kann auch beurteilt werden. Ein kurze Workflow ist in Abbildung 1dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Migration und Invasion sind wichtige Parameter für die Mobilität von Krebszellen zu beurteilen. Mithilfe von 96-poligen Scratch Tool ist es möglich, Wundheilung Assays in 2D und 3D gleichzeitig durchzuführen. Automatisches Scannen zu erleichtern, bietet eine stabile Zelle Kultur Umgebung mit minimaler Unterbrechung der Scratch Test durchgeführt mit dem 96-poligen Scratch Tool bietet neben konsequenten kratzen Wunden, ermöglicht Experimente, die robuster sind und reproduzierbar sind. 96-Well-Plattenformat bietet zus…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir würden gerne unsere finanzielle Unterstützung durch die Bloomfield Group Foundation durch Hunter Medical Research Institute (Angestiegene 13-02) zu erkennen. X.Z stützt sich auf eine APA Stipendium der University of Newcastle und der HCRA Biomarker Flaggschiff Promotionsstipendium.
Materials
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
Referências
- Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10, 683-690 (2014).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. Breast cancer metastasis. Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
