Un flujo de trabajo Simple migración/invasión usando a un sensor automatizado de células vivas
Summary
El actual protocolo describe un método integrado de investigación migración de la célula de cáncer y la invasión en una única plataforma en tiempo real, proporcionando una opción fácilmente reproducible y eficiente para estudiar la morfología y movilidad de la célula.
Abstract
Movilidad de la célula de cáncer es crucial para el inicio de la metástasis. Por lo tanto, la investigación de movimiento celular y capacidad invasiva es de gran importancia. Ensayos de migración proporcionan información básica del movimiento de la célula en un nivel 2D, mientras que los ensayos de invasión son más fisiológicamente relevantes, imitando el desplazamiento de la célula de cáncer en vivo desde el sitio original e invadiendo a través de la matriz extracelular. El protocolo actual proporciona un único flujo de trabajo para los ensayos de migración y la invasión. Junto con la cámara microscópica automatizada integrada para el módulo de análisis integrado y en tiempo real imágenes de alta definición, da a investigadores un tiempo eficiente, simple y reproducible opción experimental. Este protocolo también incluye sustituciones para los consumibles y los métodos de análisis alternativos para los usuarios elegir.
Introduction
Migración celular y la invasión son procesos biológicos importantes que permiten las funciones normales del cuerpo humano, como el cierre de la herida, invasión de la placenta en el útero y glándula mamaria morfogénesis1,2,3. El cuerpo humano tiene el control preciso y estricto de estos acontecimientos biológicos; sin embargo, hay algunas excepciones. Tumores malignos, por ejemplo, son capaces de escapar de esta salvaguardia, exhibir proliferación anormal e invadir el tejido vecino, que se llama metástasis. La metástasis es la causa principal de mortalidad relacionada con cáncer4.
Cáncer de mama es el más comúnmente diagnosticado cáncer en la mujer y es la segunda causa de muerte relacionada con el cáncer entre las mujeres en los países desarrollados en todo el mundo5. El cáncer de mama se origina de los conductos o lobulillos que constan de una o más capas de células epiteliales. En la mama normal, las células epiteliales se adhieren unos a otros y a la membrana basal a través de proteínas de membrana como la E-cadherina e integrinas6. Sin embargo, las células de cáncer de mama invasivo han perdido su polaridad y la adherencia de la célula, clásico experimentan la transición epitelial mesenquimal (EMT) y obtienen la capacidad de moverse. Después de la extravasación, estas células mover a través de la matriz extracelular (ECM) y entrar en los vasos sanguíneos o el sistema linfático, seguido luego por intravasación y crecimiento metastásico7. Comprensión de los mecanismos por los cuales esto se produce es de gran importancia, puesto que la metástasis es la causa más común de mortalidad relacionada con el cáncer y está estrechamente relacionado con el cáncer migración/invasión de la célula. Para visualizar el movimiento de las células cancerosas, ensayos de migración y la invasión son modelos ideales para el estudio de movimiento de la célula 2D y 3D, respectivamente. Migración evalúa directamente el movimiento de las células mientras que la invasión implica la interacción con el microambiente y la capacidad para degradar barreras biológicas. Los dos procesos no son totalmente independientes uno del otro, como la migración es un requisito de la invasión.
Varios métodos se han desarrollado para estudiar la migración y la invasión. Como revisado por Kramer et al., ensayos de migración como la cicatrización de heridas, análisis de micro-portador y cerca de generan un área libre para permitir a las células para que mover, evaluar el cambio de área; mientras que los análisis transwell y capilar se basan en el número de células que se mueven hacia un atrayente8. Para los ensayos de invasión, un ambiente de ECM tiene que configurarse con gel de ECM o colágeno por ejemplo, y movimiento 3D puede evaluarse mediante el control de las cuentas de área, distancia y celular de la invasión (e.g. transwell ensayo, ensayo de platypus)8. Otro tipo de ensayo de invasión es combinar las células invasoras con células no-invasivo y evaluar el comportamiento de las células invasoras (e.g. ensayos de esferoide). Los métodos tienen sus pros y contras y una manera fácil de enfoque, fácil de repetir y combinar el análisis de la migración y la invasión en un flujo de trabajo similar es preferencial en diseño experimental.
Este protocolo describe la medición de la migración celular y la invasión utilizando un reproductor de imágenes de células vivas. Es un celular en tiempo real sistema instalado en una incubadora de cultivo de célula estándar de monitoreo. Toma imágenes de alta definición según el sistema de análisis de intervalos y mediciones aplicando máscaras apropiadas a las células o fluorescentes blancos. El módulo de análisis de migración/invasión incluye el uso de una herramienta scratch de 96 pines, que es conveniente para hacer heridas de rasguño homogéneas en una monocapa de células en una placa de 96 pocillos. El mecanismo se basa en in vitro herida curación ensayos, control de movimiento celular 2D en un plástico o superficie cubierta. Invasión o movimiento 3D a través de un ECM adicional dentro de la raya de la herida también puede ser evaluada. Un breve flujo de trabajo se ilustra en la figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Migración y la invasión son parámetros importantes para evaluar la movilidad de las células cancerosas. Mediante la herramienta scratch de 96 pines, es posible llevar a cabo la cicatrización análisis en 2D y 3D simultáneamente. Aparte de facilitar la exploración automática, proporcionando un ambiente de cultura de célula estable con mínima interrupción, el rasguño ensayo realizado con la herramienta scratch de 96 pines proporciona constantes heridas rasguños, permitiendo experimentos que son más robustos y…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría reconocer el apoyo financiero de la Fundación del grupo de Bloomfield a través del Instituto de investigación médica Hunter (HMRI 13-02). XZ es apoyado por una beca de la APA a través de la Universidad de Newcastle y la beca de doctorado HCRA biomarcadores insignia.
Materials
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
Referências
- Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10, 683-690 (2014).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. Breast cancer metastasis. Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
