फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट-पॉलीसुक्रोस 70 के साथ चूहे में ग्लोमेरुलर पर्गमेबिलिटी का अत्यधिक संवेदनशील मापन
Summary
यहाँ, हम एक अत्यंत संवेदनशील, nonradioactive अनुरेखक का उपयोग कर चूहों में glomerular पारगम्यता का परीक्षण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस विधि छोटे मूत्र की मात्रा के साथ दोहराव मूत्र विश्लेषण की अनुमति देता है.
Abstract
मूत्र में एल्बुमिन की हानि (एल्बुमिनुरिया) हृदय परिणाम की भविष्यवाणी करती है। शारीरिक स्थितियों के तहत, एल्बुमिन की छोटी मात्रा glomerulus द्वारा फ़िल्टर कर रहे हैं और अवशोषण सीमा तक पहुँच गया है जब तक ट्यूबलर प्रणाली में reabsorbed. रोग अल्बुमिन निस्पंदन में जल्दी बढ़ जाती है, इस प्रकार, एल्बुमिनुरिया का विश्लेषण करके याद किया जा सकता है। इसलिए, ग्लोमेरुलर permselectivity का परीक्षण करने के लिए अनुरेखकों का उपयोग लाभप्रद प्रतीत होता है। फ्लोरोसेंटलेबल ट्रेसर फ्लोरोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी)-पॉलीसुक्रोज (यानी, FITC-फिकॉल), ग्लोमेरुलर पर्मसेल्वरिटी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। FITC-polysucrose अणुओं को स्वतंत्र रूप से ग्लोमेरुलस द्वारा फ़िल्टर किया जाता है लेकिन ट्यूबलर सिस्टम में फिर से अवशोषित नहीं किया जाता है। चूहों और चूहों में, FITC-polysucrose तकनीकी रूप से जटिल प्रक्रियाओं का उपयोग करके glomerular पारगम्यता के मॉडल में जांच की गई है (यानी, रेडियोधर्मी माप, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी [HPLC], जेल निस्पंदन). हमने चूहों में FITC-polysucrose 70 (एल्बुमिन के आकार) के लिए ग्लोमेरूलर पारगम्यता में जल्दी और छोटी वृद्धि का परीक्षण करने के लिए एक FITC-polysucrose अनुरेखक-आधारित प्रोटोकॉल को संशोधित और सुविधा प्रदान की है। इस विधि के छोटे मूत्र की मात्रा के साथ दोहराव मूत्र विश्लेषण की अनुमति देता है (5 $L). इस प्रोटोकॉल ट्रेसर FITC-polysucrose 70 नसों में लागू किया जाता है और मूत्र एक साधारण मूत्र कैथेटर के माध्यम से एकत्र की है पर जानकारी शामिल है। मूत्र एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर के माध्यम से विश्लेषण किया है और एक मूत्र एकाग्रता मार्कर (creatininine) के लिए सामान्यीकृत, जिससे तकनीकी रूप से जटिल प्रक्रियाओं से परहेज.
Introduction
ग्लोमेरूलर निस्पंदन बाधा के भीतर कार्यात्मक या संरचनात्मक दोष एल्बुमिन के लिए ग्लोमेरूलर पारगम्यता में वृद्धि करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप मूत्र (एल्बुमिनुरिया) में एल्बुमिन का पता लगाया जाता है। Albuminuria हृदय परिणाम की भविष्यवाणी की है और glomerular चोट1के लिए एक महत्वपूर्ण मार्कर है. यहां तक कि एल्बुमिनुरिया के निम्न स्तर, सामान्य सीमा के भीतर झूठ बोल रही है, एक वृद्धि हुई हृदय जोखिम1के साथ जुड़े रहे हैं.
शारीरिक स्थितियों के अंतर्गत एल्बुमिन को ग्लोमेरुलस के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है और ट्यूबलर प्रणाली2,3में लगभग पूरी तरह से पुन: अवशोषित किया जाता है। चूहों में, मूत्र में एल्बुमिन का पता लगाने आमतौर पर मूत्र संग्रह के 24 एच से एक एल्बुमिन एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) द्वारा किया जाता है। यदि मूत्र से एक 24 एच मूत्र संग्रह या हाजिर मूत्र का उपयोग किया जाता है, तो परख संवेदनशीलता समस्याओं के कारण एल्बुमिन सांद्रता में छोटे अंतर को याद किया जा सकता है। अधिकांश शोधकर्ताओं, इसलिए, पशु मॉडल जिसमें एल्बुमिनुरिया विषाक्त पदार्थों, दवाओं, और गुर्दे की सर्जरी के कारण मजबूत गुर्दे की चोट से प्रेरित है का उपयोग करें।
इसलिए, ग्लोमेरूलर पारगम्यता में छोटे और क्षणिक परिवर्तनों का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील विधि का निष्कर्ष क्षेत्र के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। Rippe एट अल एक फ्लोरोसेंट लेबल अनुरेखक, अर्थात् FITC-polysucrose 70 (यानी, FITC-Ficoll 70) को लागू करने से glomerular पारगम्यता का परीक्षण करने के लिए एक चूहा मॉडल प्रस्तुत किया है4. अनुरेखक अनुप्रयोग ग्लोमेरुलर पारगम्यता (मिनट के भीतर) में अल्पकालिक परिवर्तनों के परीक्षण की अनुमति देता है और बहुत संवेदनशील4होता है। दो अध्ययनों में चूहों में ट्रेसर विधि का प्रयोग किया गयाहै 5,6. इसके लाभों के बावजूद, इस विधि, दुर्भाग्य से, नुकसान है: यह तकनीकी रूप से बहुत जटिल है, रेडियोधर्मी, और आक्रामक. मूत्र का आगे विश्लेषण केवल जेल निस्पंदन या आकार-निष्कर्ष HPLC5,6 का उपयोग करके पूरा कियाजाताहै।
इस पेपर के भीतर, हम एक वैकल्पिक, संवेदनशील, nonradioactive, और तेजी से विधि fluorcently लेबल FITC-polysucrose 70 का उपयोग कर चूहों में glomerular पारगम्यता को मापने के लिए प्रस्तुत करते हैं. एक transurethral कैथेटर शुरू करने से, मूत्र संग्रह मूत्राशय पंचर की तुलना में कम इनवेसिव है, मूत्र throtomy, और suprapubic कैथेटर आवेदन, और मूत्र संग्रह की अनुमति देता है कम से कम हर 30 मिनट. मूत्र विश्लेषण छोटी मात्रा से किया जाता है (5 डिग्री एल) का उपयोग कर एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर. मूत्र में अनुरेखक सांद्रता एक एंजाइमी क्रिएटिनिन परख का उपयोग कर मूत्र में क्रिएटिनिन सांद्रता के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं।
इसलिए, इस उपन्यास विधि वृद्धि हुई glomerular पारगम्यता के साथ जल्दी glomerular चोट का अध्ययन करने के लिए एक संवेदनशील उपकरण प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तुत विधि अन्वेषक एक अनुरेखक का उपयोग कर एक बहुत ही संवेदनशील तरीके से चूहों में glomerular पारगम्यता का परीक्षण करने के लिए सक्षम बनाता है। इस विधि के साथ, ग्लोमेरूलर पारगम्यता में अल्पकालिक वृद्धि का ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों क्रिस्टीना Schwandt, Blanka Duvnzak, और निकोला Kuhr उनके असाधारण तकनीकी सहायता और डॉ डेनिस सोहन फ्लोरोसेंट स्कैन के साथ उनकी मदद के लिए धन्यवाद. इस शोध के लिए ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था L.C.R. और L.S. funder अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
Referências
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, , et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
- Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
- Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
- Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
- Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
- Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
- Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
- Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
- Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
- Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
- Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D’Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
