Svært følsom måling av Glomerulær permeabilitet i mus med Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å teste glomerulær permeabilitet i mus ved hjelp av en svært følsom, radioaktivt Tracer. Denne metoden tillater repeterende urin analyser med små urin volumer.
Abstract
Tapet av albumin i urinen (albuminuri) spår kardiovaskulære utfall. Under fysiologiske forhold filtreres små mengder albumin av glomerulus og reabsorberes i rørsystemet frem til absorpsjons grensen nås. Tidlig økning i patologisk albumin filtrering kan dermed bli savnet ved å analysere albuminuri. Derfor, bruk av Bevegelsesuskarphet å teste glomerulær permselectivity synes fordelaktig. Fluorescensmerkete merket Tracer fluorescein isothiocyanate (FITC)-polysucrose (dvs. FITC-Ficoll), kan brukes til å studere glomerulær permselectivity. FITC-polysucrose molekyler er fritt filtrert av glomerulus men ikke reabsorberes i rørformede systemet. I mus og rotter, FITC-polysucrose har blitt undersøkt i modeller av glomerulær permeabilitet ved hjelp av teknisk komplekse prosedyrer (dvs. radioaktive målinger, høy ytelse væske kromatografi [HPLC], gel filtrering). Vi har endret og tilrettelagt en FITC-polysucrose Tracer-basert protokoll for å teste tidlig og små økninger i glomerulær permeabilitet til FITC-polysucrose 70 (størrelsen av albumin) i mus. Denne metoden tillater repeterende urin analyser med små urin mengder (5 μL). Denne protokollen inneholder informasjon om hvordan Tracer FITC-polysucrose 70 brukes intravenøst og urin er samlet inn via en enkel urin kateter. Urin analyseres via en fluorescens plate leser og normalisert til en urin konsentrasjon markør (kreatinin), og dermed unngår teknisk komplekse prosedyrer.
Introduction
Funksjonelle eller strukturelle defekter innenfor glomerulær filtrerings barriere øke glomerulær permeabilitet til albumin, noe som resulterer i påvisning av albumin i urinen (albuminuri). Albuminuri spår kardiovaskulære utfall og er en viktig markør for glomerulær Kader1. Selv lave nivåer av albuminuri, ligger innenfor normalområdet, er forbundet med økt kardiovaskulær risiko1.
Under fysiologiske forhold, er albumin filtrert gjennom glomerulus og er nesten helt reabsorberes i rørformede system2,3. I mus, påvisning av albumin i urinen er vanligvis utført av en albumin enzym-knyttet immunosorbentanalyse analysen (ELISA) fra 24 h av urin samling. Hvis urin fra en 24 h urin samling eller flekk urin brukes, små forskjeller i albumin konsentrasjoner kan bli savnet på grunn av analysen følsomhet problemer. De fleste forskere derfor bruke dyremodeller der albuminuri er indusert av robust nyreskader på grunn av giftstoffer, narkotika, og nyre kirurgi.
Derfor er funn av en følsom metode for å oppdage små og forbigående endringer i glomerulær permeabilitet svært viktig for feltet. Rippe et al. har presentert en rotte modell for å teste glomerulær permeabilitet ved å bruke en fluorescensmerkete merket Tracer, nemlig FITC-polysucrose 70 (dvs. FITC-Ficoll 70), på størrelse med albumin4. Den Tracer programmet tillater testing av kortsiktige endringer i glomerulær permeabilitet (i løpet av minutter) og er svært følsom4. To studier har brukt Tracer metoden i mus5,6. Til tross for sine fordeler, denne metoden, dessverre, har ulemper: det er teknisk svært kompleks, radioaktiv, og invasiv. Ytterligere analyse av urinen oppnås bare ved bruk av gel-filtrering eller størrelsesekskludering HPLC.
Innenfor dette papiret, presenterer vi en alternativ, følsom, radioaktivt, og rask metode for å måle glomerulær permeabilitet i mus ved hjelp av fluorescensmerkete merket FITC-polysucrose 70. Ved å innføre et Transurethral kateter, urin samling er mindre invasiv enn blære punktering, urethrotomy, og suprapubisk kateter søknad, og tillater urin samling minst hver 30 min. urin analyse utføres fra små mengder (5μL) ved hjelp av en fluorescerende plate leser. Tracer konsentrasjoner i urinen er normalisert til kreatinin konsentrasjoner i urinen ved hjelp av en enzymatisk kreatinin analysen.
Derfor, denne romanen metoden tilbyr et følsomt verktøy for å studere tidlig glomerulær skade med økt glomerulær permeabilitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den presenterte metoden gjør det mulig for etterforsker å teste glomerulær permeabilitet i mus på en svært følsom måte ved hjelp av en Tracer. Med denne metoden, kortsiktige økninger i glomerulær permeabilitet kan diagnostiseres ved hjelp av bare små mengder urin. De mest kritiske trinnene for vellykket mestring denne teknikken er 1) utvikle manuell ekspertise i musen kirurgi, spesielt i kanyleringen av en sentral vene, 2) plassere urin kateter uten å skade slimhinnen, og 3) manuell ekspertise i håndtering 38…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Christina Schwandt, Blanka Duvnjak, og Nicola Kuhr for deres eksepsjonelle tekniske assistanse og Dr. Dennis Sohn for hans hjelp med fluorescens Scan. Denne forskningen ble støttet av en bevilgning av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 til L.C.R. og L.S. Funder hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
Referências
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, , et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
- Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
- Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
- Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
- Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
- Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
- Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
- Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
- Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
- Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
- Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D’Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
