Medição altamente sensível da permeabilidade glomerular em camundongos com isotiocianato de fluoresceina-polisacarose 70
Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para testar a permeabilidade glomerular nos ratos usando um Tracer altamente sensível, nonradioativo. Este método permite análises repetitivas da urina com volumes pequenos da urina.
Abstract
A perda de albumina na urina (albuminúria) preafirma o desfecho cardiovascular. Em condições fisiológicas, pequenas quantidades de albumina são filtradas pelo glomérulo e reabsorvidas no sistema tubular até o limite de absorção ser atingido. Os aumentos adiantados na filtração patológica da albumina podem, assim, ser faltado analisando o Albuminuria. Portanto, o uso de traçadores para testar a permseletividade glomerular parece vantajoso. O isotiocianato do Tracer fluorescently etiquetado do fluoresceína (FITC)-polysacarose (isto é, FITC-Ficoll), pode ser usado para estudar o permselectivity glomerular. As moléculas FITC-polisacarose são livremente filtradas pelo glomérulo, mas não reabsorvidas no sistema tubular. Em camundongos e ratos, FITC-polysacarose tem sido investigado em modelos de permeabilidade glomerular usando procedimentos tecnicamente complexos (i.e., medições radioativas, cromatografia líquida de alta eficiência [HPLC], filtração de gel). Nós modificamos e facilitamos um protocolo Tracer-baseado do FITC-polysacarose para testar aumentos adiantados e pequenos na permeabilidade glomerular a FITC-polysacarose 70 (tamanho da albumina) nos ratos. Este método permite análises repetitivas da urina com volumes pequenos da urina (5 μL). Este protocolo contém informações sobre como o Tracer FITC-polysacarose 70 é aplicado por via intravenosa e a urina é coletada através de um cateter urinário simples. A urina é analisada através de um leitor de placas de fluorescência e normalizada para um marcador de concentração de urina (creatinina), evitando assim procedimentos tecnicamente complexos.
Introduction
Defeitos funcionais ou estruturais dentro da barreira de filtração glomerular aumentam a permeabilidade glomerular à albumina, resultando na detecção de albumina na urina (albuminúria). A albuminúria preafirma o desfecho cardiovascular e é um importante marcador para lesão glomerular1. Mesmo os baixos níveis de albuminúria, encontrando-se dentro da escala normal, são associados com um risco cardiovascular aumentado1.
condições fisiológicas, a albumina é filtrada através do glomérulo e é quase completamente reabsorvida no sistema tubular2,3. Em camundongos, a detecção de albumina na urina é geralmente realizada por um ensaio imunoenzimático de albumina (ELISA) a partir de 24 h de coleta de urina. Se a urina de uma coleta de urina de 24 h ou urina local for usada, pequenas diferenças nas concentrações de albumina podem ser perdidas devido a problemas de sensibilidade do ensaio. A maioria dos pesquisadores, portanto, usam modelos animais em que a albuminúria é induzida por lesão renal robusta devido a toxinas, drogas e Cirurgia renal.
Portanto, o achado de um método sensível para detectar alterações pequenas e transitórias na permeabilidade glomerular é muito importante para o campo. Rippe et al. apresentaram um modelo de rato para testar a permeabilidade glomerular aplicando um traçador fluorescentamente rotulado, a saber FITC-polysacarose 70 (ou seja, FITC-Ficoll 70), no tamanho da albumina4. A aplicação do traçador permite o teste de mudanças a curto prazo na permeabilidade glomerular (dentro dos minutos) e é muito sensível4. Dois estudos utilizaram o método Tracer em camundongos5,6. Apesar de seus benefícios, este método, infelizmente, tem desvantagens: é tecnicamente muito complexo, radioativo e invasivo. Uma análise mais adicional da urina é conseguida somente usando a filtração do gel ou a HPLC5,6da tamanho-exclusão.
Neste trabalho, apresentamos um método alternativo, sensível, não radioativo e rápido para medir a permeabilidade glomerular em camundongos utilizando FITC-polysacarose 70 fluorescentamente rotulado. Introduzindo um cateter transuretral, a coleção da urina é menos invasora do que a punctura da bexiga, o Urethrotomy, e a aplicação suprapúbica do cateter, e permite a coleção da urina pelo menos cada 30 minutos. a análise de urina é realizada a partir de pequenas quantidades (5μl) leitor de placas fluorescentes. As concentrações de traçador na urina são normalizadas para concentrações de creatinina na urina usando um ensaio de creatinina enzimática.
Conseqüentemente, este método novo oferece uma ferramenta sensível para estudar ferimento glomerular adiantado com permeabilidade glomerular aumentada.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método apresentado permite ao investigador testar a permeabilidade glomerular em camundongos de uma maneira muito sensível usando um traçador. Com este método, os aumentos a curto prazo na permeabilidade glomerular podem ser diagnosticados usando somente pequenas quantidades de urina. As etapas mais críticas para dominar com sucesso esta técnica são 1) desenvolver a perícia manual na cirurgia do rato, especial no canulação de uma veia central, 2) coloc o cateter urinário sem prejudicar a mucosa, e 3) períci…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem Christina Schwandt, Blanka Duvnjak, e Nicola Kuhr por sua assistência técnica excepcional e Dr. Dennis Sohn por sua ajuda com a varredura de fluorescência. Esta pesquisa foi apoiada por uma subvenção da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 para L.C.R. e L.S. O financiador não teve papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
Referências
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