हम आणविक शटल, जहां सतह का पालन kinesin मोटर प्रोटीन प्रेरित डाई-लेबल microtubules का निर्माण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । सतह के साथ kinesins की कमजोर बातचीत के लिए यह उनके प्रतिवर्ती लगाव को सक्षम बनाता है । यह एक नेनो प्रणाली है जो गतिशील विधानसभा और इसके घटकों के विधानसभा प्रदर्शित करता है, जबकि अपनी कार्यक्षमता को बनाए रखने बनाता है ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे kinesin बनाने के लिए kinesins की सतह के लिए एक कमजोर और प्रतिवर्ती लगाव के साथ आणविक शटल संचालित । पिछले प्रोटोकॉल के विपरीत, इस प्रणाली में, microtubules समाधान से kinesin मोटर प्रोटीन की भर्ती और उंहें एक सतह पर जगह है । kinesins, बारी में, desorbing वापस थोक समाधान में पहले सतह के साथ microtubules के ग्लाइडिंग की सुविधा है, इस प्रकार के लिए फिर से भर्ती होने के लिए उपलब्ध किया जा रहा होगा । इस निरंतर विधानसभा और विधानसभा इस तरह के microtubules ग्लाइडिंग द्वारा अस्थाई kinesin ट्रेल्स के गठन के रूप में इस प्रणाली में गतिशील व्यवहार हड़ताली करने के लिए सुराग ।
इस प्रयोग के दौरान कई प्रायोगिक तरीकों का वर्णन किया जाएगा: यूवी की तुलना spectrophotometry के लिए रिएजेंट के स्टॉक समाधानों की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए किया जाएगा, coverslips पहले ओजोन और पराबैंगनी (यूवी) इलाज किया जाएगा और फिर silanized इससे पहले प्रवाह कोशिकाओं में रखा जा रहा है, और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी एक साथ छवि kinesin मोटर्स और microtubule रेशा करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
सक्रिय nanosystems के व्यवहार को नियंत्रित करने वाले इंटरैक्शन को हमेशा लंबे समय तक जिया जाता है, लगभग अपरिवर्तनीय बांड1,2,3,4,5,6 ,7,8. इस का एक अच्छी तरह से अध्ययन उदाहरण microtubule-kinesin प्रणाली है, जहां ग्लाइडिंग microtubules अचल सतह बंधे kinesin मोटर्स1,2,3,4द्वारा चालित हैं, 5. सिस्टम में घटक एक दूसरे से जुड़े reversibly है सैद्धांतिक रूप से अध्ययन किया गया है9,10 और macroscale11,12पर हासिल की है, लेकिन इन प्रणालियों को नीचे स्केलिंग नेनो चुनौतीपूर्ण रहा है । इस के लिए प्रमुख कारणों में से एक यह है कि तोड़ने और घटकों के बीच बांड सुधार अक्सर पर्यावरण की स्थिति में एक बड़ा परिवर्तन की आवश्यकता है । हालांकि इस तरह के परिवर्तन पिछले13,14,15में लागू किया गया है, वे अपने पर्यावरण के लिए अनुकूल के बजाय प्रणाली को संशोधित करने पर भरोसा करेंगे । डिजाइन आणविक पैमाने पर सिस्टम में जो घटक लगातार इकट्ठा और संरचनाओं में समग्र पर्यावरण जिसमें प्रयोग जगह लेने के लिए गतिशील व्यवहार की एक विस्तृत श्रृंखला की खोज के लिए दरवाजा खुला होगा परेशान बिना पुनर्निर्माण 16 , 17. शी.
यहां, हम वर्णन और एक गतिशील कोडांतरण और नेनो में प्रणाली काम कर कोडांतरण बनाने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का प्रदर्शन । प्रणाली और उसके सामांय व्यवहार से पहले शुरू किया गया है18: microtubule रेशा reversibly सतह से बंधे kinesin-1 मोटर्स की पटरियों द्वारा चालित हैं । इन kinesin मोटर प्रोटीन समाधान से भर्ती कर रहे हैं मदद करने के लिए प्रेरित microtubules आगे, desorbing से पहले फिर शीघ्र ही बाद में । एक बार समाधान में वापस, वे फिर से भर्ती किया जा सकता है एक नया microtubule में वृद्धि । पिछले13,14,15में, तोड़ने और बांड की सुधार आवश्यक पर्यावरणीय संशोधनों; इसके विपरीत, हमारे प्रवाह सेल के पर्यावरण अपरिवर्तित रहता है, जबकि kinesin मोटर्स सतह के साथ बातचीत ।
इस प्रोटोकॉल के लिए दिलचस्पी शोधकर्ताओं में मदद मिलेगी (1) प्रोटोकॉल के सभी कदम कल्पना, और (2) परख के इस प्रकार समस्या निवारण के साथ सहायता करते हैं । यह हावर्ड एट अल. १९९३19में वर्णित प्रक्रियाओं से व्युत्पंन किया गया है ।
इस काम में, हम एक सक्रिय नेनो प्रणाली है जो स्वयं को कमजोर-बाध्यकारी इमारत ब्लॉकों के लिए अपने स्वयं के ट्रैक का निर्माण इकट्ठा प्रस्तुत करते हैं । के रूप में चित्र 1में दिखाया गया है, ग्लाइडिंग microtubules समाधान से kinesin मोटर्स जमा और उंहें सतह पर जमा । kinesin मोटर्स समाधान के लिए लौटने से पहले समय की एक छोटी अवधि के लिए microtubule के जाग में रहते हैं । इस प्रकार, इस प्रयोग में, kinesin 3 राज्यों के बीच वैकल्पिक मोटर्स:
(1) एक microtubule एकल बाध्य राज्य: यह तब होता है जब एक kinesin पहले एक microtubule को बांधता है । यह (2) राज्य के साथ संतुलन में मौजूद है ।
(2) एक डबल-बाउंड राज्य: इस मामले में, एक microtubule एकल बंधे kinesin भी अपनी-टैग के माध्यम से सतह को बांधता है । इस दोहरे बाध्य राज्य microtubule लैबोरेटरी के लिए अनुमति देता है ।
(3) एक एकल सतह से बंधे राज्य: एक डबल-बाउंड kinesin कि microtubule के अंत तक चला गया है और सतह से अभी तक desorbed नहीं है इस राज्य में है । इन मोटर्स चित्रा 1 में देखा जा सकता है (संयुक्त और हरे चैनल): वे कई micrometers के लिए microtubule की पूंछ के पीछे का विस्तार और अपनी कम निशान फार्म ।
इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम स्लाइड पर hydrophobic सतह का गठन है । न केवल यह खतरनाक रसायनों का उपयोग करता है, लेकिन यह भी खूंटी-PPG-ंत् समूह के साथ कार्यात्मक खूंटी की अनुमति देता है कोट करने के लिए सतह, जो तो kinesin सतह के लिए reversibly बांध करने के लिए अनुमति देता है । एक अंय महत्वपूर्ण कदम तेल के साथ प्रवाह सेल सील है । यह लंबे समय तक इमेजिंग के लिए प्रवाह सेल वाष्पीकरण में तरल बिना अनुमति देता है ।
इस तकनीक में प्राथमिक संशोधनों microtubule एकाग्रता, kinesin एकाग्रता, और एटीपी एकाग्रता बदलने से मिलकर बनता है । microtubule एकाग्रता बदलने से सतह पर ग्लाइडिंग microtubules की संख्या में बदलाव आएगा. kinesin एकाग्रता बदलने से kinesin अणुओं की संख्या में बदलाव आएगा जो microtubule को बाँध सकता है. हालांकि, इस प्रयोग में पहले से ही परिभाषित मात्रा के ऊपर kinesin एकाग्रता बढ़ाने से बैकग्राउंड प्रतिदीप्ति बढ़ सकता है, जिससे ग्लाइडिंग microtubules पीछे छोड़े गए kinesin ट्रेल्स को देखना ज्यादा मुश्किल होता है । इस बीच, 10 µ मीटर नीचे एटीपी सांद्रता कम काफी microtubule ग्लाइडिंग वेग कम हो जाएगा । यदि यह प्रभाव वांछित है, यह creatine फॉस्फेट और phosphokinase से मिलकर एक एटीपी पुनर्सृजन प्रणाली का उपयोग करने के लिए आवश्यक है ।
इस तकनीक की एक संभावित सीमा है कि, प्रणाली के बड़े सक्रिय kinesin सामग्री के कारण, एटीपी तेजी से भस्म किया जा सकता है, और प्रयोगों कुछ शर्तों में एक घंटे से भी कम पिछले हो सकता है. यह उदाहरण के लिए मामला होगा अगर एक एक दोहरा उच्च kinesin एकाग्रता और पांच क्या इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया है से उच्च microtubule एकाग्रता गुना इस्तेमाल किया ।
हमारे पिछले काम18में, हम microtubules साथ kinesin मोटर्स के स्थानिक वितरण का अध्ययन किया, साबित करना है कि ग्लाइडिंग microtubules समाधान से kinesin मोटर्स जमा, की लंबाई के साथ मोटर्स के घनत्व की वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप microtubule । हमने यह भी पाया कि ‘ microtubules ग्लाइडिंग स्थिरता समाधान kinesin एकाग्रता और microtubule वेग पर एक रैखिक निर्भरता का प्रदर्शन किया ।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल नेनो इंजीनियर सिस्टम में प्रोटीन मोटर्स के एक अधिक कुशल उपयोग के लिए रास्ता प्रशस्त करता है और सक्रिय nanosystems के डिजाइन में आगे की जांच के लिए है कि गतिशील संतुलन में हैं । इसके अलावा, इस प्रणाली के गतिशील प्रकृति यह आत्म चिकित्सा और आणविक घटकों के गतिशील प्रतिस्थापन, इंजीनियर और प्राकृतिक संरचनाओं के बीच की खाई का हिस्सा बंद का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में सेवा करने की अनुमति देता है ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक कृतज्ञता NSF अनुदान NSF-DMR १८०७५१४ के तहत वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । लेखकों ने GFP-kinesin प्रोटीन प्रदान करने के लिए जी Bachand और वी. Vandelinder का धन्यवाद किया । यह काम किया गया था, भाग में, एकीकृत Nanotechnologies के लिए केंद्र में, विज्ञान उपयोगकर्ता ऊर्जा विभाग के लिए संचालित सुविधा का एक कार्यालय (डो) लॉस एलामोस राष्ट्रीय प्रयोगशाला द्वारा विज्ञान के कार्यालय (अनुबंध सं. de-AC52-06NA25396) और Sandia राष्ट्रीय प्रयोगशालाओं (कांग्रेस-पथ no. ९७ de-AC04-94AL85000) । लेखक Dr. जेनिफर Neff और AllVivo संवहनी खूंटी-PPG-ंत् के साथ कार्यात्मक खूंटी के अपने उपहार के लिए धंयवाद ।
488 nm laser | Omicron Laserage | LuxX 488-150 | |
642 nm laser | Omicron Laserage | LuxX 642 | |
Casein | Sigma | C7078-500G | |
Catalase from bovine liver | Sigma | C40-500MG | |
Creatine Phosphate | Sigma | P-7936 | |
Creatine Phosphokinase | Sigma | C3755-500UN | |
D-Glucose | Sigma | G2133-50KU | |
Dichlorodimethylsilane solution | Sigma | 40140-25ML | Toxic |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma | 34869-100ML | |
Dithiothreitol | Sigma | D0632-5G | Toxic |
Eclipse TI | Nikon Instruments | ||
eGFP rkin430 | Provided by George Bachand | ||
EGTA | Sigma | E4378-25G | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
Glucose Oxidase | Sigma | G0543-10KU | |
Guanosine Triphosphate | Sigma | G8877-10MG | |
Kimwipes Delicate Task Wipers | Sigma Pharmaceuticals | 8089 | |
Magnesium Chloride | Sigma | M1028-100ML | |
Methanol | Fisher Chemical | A412 | Toxic |
Milli-Q Water Purification System | Millipore Corporation | ||
Nickel Sulfate | Sigma | 656895-50G | |
Paclitaxel | Sigma | T1912-5MG | |
PIPES | Sigma | P-6757 | |
Pluronic F108-NTA | Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular | PEG-PPG-PEG-NTA | |
Pluronic F-108 | Sigma | 542342-250G | PEG-PPG-PEG |
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 21-403-190 | |
Toluene | Fisher Chemical | T324 | Toxic |
Tubulin, HiLyte647-labeled | Cytoskeleton, Inc. | TL670M | |
UV Ozone Procleaner | BioForce Nanosciences | PC440 | |
Whatman Puradisc syringe filters | Sigma | WHA67840402 | |
Zyla 4.2 sCMOS Camera | Andor Technology | sCMOS 4.2 |