Método do impalement do microelétrodo para gravar o potencial da membrana de uma artéria cerebral média Cannulated

Summary

O objetivo preliminar deste artigo é fornecer detalhes de como gravar o potencial da membrana (V_m) da artéria cerebral média usando o método do impalement do microelétrodo. A artéria cerebral média canulada é equilibrada para ganhar o Tom miogênico, e a parede do vaso é empalada usando microeletrodos de alta resistência.

Abstract

O potencial de membrana (V_m) das células musculares lisas vasculares determina o tom do vaso e, portanto, o fluxo sanguíneo para um órgão. Mudanças na expressão e função de canais iônicos e bombas eletrogênicas que regulam V_m em condições de doença poderiam potencialmente alterar v_m, tônus vascular e fluxo sanguíneo. Assim, uma compreensão básica da eletrofisiologia e os métodos necessários para gravar com precisão V_m em Estados saudáveis e doentes são essenciais. Este método permitirá modulando V_m usando diferentes agentes farmacológicos para restaurar v_m. Embora existam vários métodos, cada um com suas vantagens e desvantagens, este artigo fornece protocolos para registro de V_m de vasos de resistência canulados, como a artéria cerebral média, utilizando o método de empalamento do microeletrodo. As artérias cerebrais médias podem ganhar o Tom myogenic em uma câmara do miógrafo, e a parede da embarcação é empalada usando microeletrodos da resistência elevada. O sinal de V_m é coletado através de um electrometer, digitalizado, e analisado. Este método fornece uma leitura exata do V_m de uma parede da embarcação sem danificar as pilhas e sem mudar a resistência da membrana.

Introduction

O potencial de membrana (V_m) de uma célula refere-se à diferença relativa da carga iónica através da membrana plasmática e a permeabilidade relativa da membrana a estes íons. O V_m é gerado pela distribuição diferencial de íons e é mantido por canais de íons e bombas. Os canais iônicos como K⁺, na⁺e CL⁻ contribuem substancialmente para o repouso V_m. As pilhas de músculo liso vasculares (VSMCs) expressam mais de quatro tipos diferentes de K⁺ Channels¹, dois tipos de CA^{2 +} Channels tensão-fechados (vgcc)², mais de dois tipos de CL⁻ canaletas^{3, 4. º , 5}, loja-operado CA^{2 +} canais⁶, estiramento-ativado catiões^7,8, e electrogénico sódio-potássio ATPase bombas⁹ em suas membranas plasmáticas, todos os quais podem ser envolvidos na regulação da V_m.

O V_m de VSMCs depende da pressão do lúmen. Em vasos não pressurizados, V_m varia de-50 a-65 MV, porém, em segmentos arteriais pressurizados, v_m varia de-37 a-47 MV¹⁰. A elevação da pressão intravascular faz com que os vsmcs despolarize¹¹, diminua o limiar para a abertura de vgcc, e aumente o afluxo do cálcio que contribui ao desenvolvimento do Tom myogenic¹². Pelo contrário, em vasos passivos ou não-pressurizados, a hiperpolarização da membrana, devido à alta atividade de K⁺ Channel, impedirá a abertura do vgcc, resultando em uma entrada de cálcio limitada e uma diminuição no cálcio intracelular, contribuindo para menos tônus vascular¹³. Assim, V_m devido às mudanças na pressão do lúmen parece desempenhar um papel essencial no desenvolvimento do Tom vascular, e ambos Vgcc e K⁺ canais desempenham um papel crucial na regulação da V_m.

V_m varia entre o tipo de embarcação e as espécies. V_m é-54 ± 1,3 MV em tiras arteriais mesentéricas superiores¹⁴,-45 ± 1 mV nas artérias cerebrais médias de ratos a 60 mmHg de pressão do lúmen¹²e-35 ± 1 mV em artérias parenquimatosas de ratos a 40 mmHg de pressão do lúmen¹⁵. O V_m de repouso gravado em músculo linfático de rato não esticado é de-48 ± 2 MV¹⁶. V_m de VSMCs cerebrais é mais negativo do que nas artérias periféricas. Na comparação, as artérias cerebrais médias Feline foram relatadas para ter um V_m de aproximadamente-70 MV, quando as artérias mesentérica e coronárias foram relatadas para ter-49 e-58 MV, respectivamente^17,18. As diferenças na V_m em leitos vasculares podem refletir as diferenças na expressão e função dos canais iônicos e das bombas eletrogênicas de sódio e potássio.

Os aumentos e as diminuições em V_m são referidos como a despolarização da membrana e a hiperpolarização, respectivamente. Essas alterações na V_m desempenham um papel central em muitos processos fisiológicos, incluindo gating de canal iônico, sinalização celular, contração muscular e propagação do potencial de ação. A uma pressão fixa, muitos compostos vasodilatadores endógenos e sintéticos que ativam canais K⁺ causam hiperpolarização da membrana, resultando em vasodilatação^1,13. Inversamente, a despolarização sustentada da membrana é vital na vasoconstrição agonista-induzida ou receptor-negociada¹⁹. V_m é uma variável crítica que não só regula CA^{2 +} afluxo através do vgcc¹³ , mas também influencia a liberação de CA^{2 +} de lojas internas^20,21 e CA^{2 +}-sensibilidade de o aparelho contrátil²².

Embora existam vários métodos para gravar V_m de diferentes tipos de células, os dados coletados a partir do método de empalamento de microeletrodos de vasos canulados parece ser mais fisiológico do que os dados obtidos a partir de VSMCs isolados. Quando gravado de VSMC isolado usando métodos atuais da braçadeira, V_m é visto como hyperpolarizations transientes espontâneos em VSMCs²⁴. VSMCs isolados não estão no Syncytium, e as mudanças na resistência da série podem contribuir ao comportamento oscilatório de V_m. Por outro lado, o comportamento oscilatório não é observado quando o V_m é gravado a partir de vasos intactos, provavelmente devido ao contato celular entre os VSMCs que estão no Syncytium na artéria e são somados em todo o vaso levando a um v_m ^{estável 24}. assim, a medida de V_m dos vasos pressurizados usando a técnica padrão do empalement do microelétrodo é relativamente próxima às circunstâncias physiological.

A gravação de V_m de vasos canulados poderia fornecer informações vitais, uma vez que v_m de vsmcs que estão em Syncytium é um dos principais determinantes do tônus vascular e fluxo sanguíneo, e a modulação do v_m poderia fornecer uma maneira de dilatar ou contraem os vasos sanguíneos. Assim, é essencial compreender a metodologia envolvida na gravação de V_m. Este artigo descreve a gravação intracelular de V_m das artérias cerebrais médias canulados (MCAS) usando um método do impalement do microelétrodo. Este protocolo descreverá como preparar MCAS, microeletrodos, configurar o eletrômetro e executar o método de empalamento para gravar V_m. Também, os dados representativos, os problemas comuns que foram encontrados ao usar este método e os problemas potenciais são discutidos.

Protocol

Os ratos machos foram alojados na unidade de cuidados com animais da UMMC, que é aprovada pela Associação para avaliação e acreditação de cuidados com animais de laboratório (AAALAC). Os animais tiveram livre acesso à alimentação e à água durante todo o estudo. Os animais foram mantidos em ambiente controlado com temperatura a 24 ± 2 ° c, níveis de umidade de 60 – 80% e 12 h de luz/ciclos escuros. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais da UMMC. <p class="jove_t…

Representative Results

O método apresentado pode ser usado confiantemente para gravar Vm em embarcações canulados. Um breve procedimento descrevendo como isolar MCA do cérebro é apresentado na Figura 1a. Após separar o cérebro do crânio, o MCA foi dissecado para fora e coloc em um prato de Petri que contem o baixo cálcio PSS. Parte do tecido conjuntivo que foi anexado também foi dissecado juntamente com MCA usando tesouras de mola e fórceps para evitar danos a…

Discussion

Este artigo fornece as etapas necessárias em como usar um método afiado do impalement do microelétrodo para gravar V_m de uma preparação canulados da embarcação. Este método é amplamente utilizado, e oferece gravações consistentes de alta qualidade de V_m que respondem a uma vasta gama de perguntas experimentais.

Algumas considerações críticas e etapas de solução de problemas são descritas aqui para garantir o sucesso do método. A qualidade do microeletrod…

Materials

Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser	Parkland scientific	V3000PK
Dissection microscope	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer Bone Cutter	Fine science tools	16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps	Fine science tools	11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt	Fine science tools	14008-14
Suture	Harvard Apparatus	72-3287
Vannas Spring Scissors	Fine science tools	15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera	Qimaging, , BC	Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier	WPI	FD223A
In-line pressure transducer	Harvard Apparatus, MA	MA1 72-4496
Micromanipulator	Thor labs	PCS-5400
Microelectrodes	Warner Instruments LLC, CT	G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe)	WPI	MF28G67-5
Microelectrode holder	WPI	MEH1SF
Myograph	Living Systems Instrumentation, VT	CH-1-SH
Puller	Sutter Instrument, San Rafael, CA	P-97
Vibration-free table	TMC	3435-14
Softwares
Clampex 10	Molecular devices
p Clamp 10	Molecular devices
Imaging software	Nikon, NY	NIS-elements
Chemicals
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
Glucose	Sigma	G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761