Denna studie beskriver processen för gavaging exakta mängder probiotika till nyfödda möss. Experimental set-up var optimerad för att inkludera men är inte begränsat till probiotiska dosering, metoder för administration och kvantifiering av bakterier i tarmen.
Adult musmodeller har använts att förstå mekanismen bakom sjukdomsutvecklingen hos människor. Tillämpligheten av studier som gjorts i vuxen musmodeller till neonatala sjukdomar är begränsad. För att bättre förstå sjukdomsprogression, värd svaren och långsiktiga effekterna av interventioner hos nyfödda, är en neonatal musmodell sannolikt en bättre passform. Glesa användningen av neonatal musmodeller kan delvis hänföras till de tekniska svårigheterna av att arbeta med dessa små djur. En neonatal musmodell utvecklades att avgöra effekterna av probiotiska administration tidigt i livet och särskilt bedöma möjligheten att upprätta kolonisationen i tarmkanalen nyfödd mus. Specifikt, för att bedöma probiotiska kolonisationen i neonatal musen, levererades Lactobacillus plantarum (LP) direkt i neonatal mus mag-tarmkanalen. Därför gavs LP till möss genom att mata genom intra-esofagus (IE) sondmatning. En mycket reproducerbar metod utvecklades för att standardisera processen för IE sondmatning som gör en korrekt administration av probiotiska doser samtidigt minimera trauma, en aspekt som är särskilt viktigt med tanke på bräckligheten i nyfödda möss. Begränsningar av denna process inkluderar möjligheter av matstrupen irritation eller skador och aspiration om gavaged felaktigt. Detta synsätt utgör en förbättring jämfört med nuvarande praxis eftersom IE sondmatning i distala matstrupen minskar risken för aspiration. Efter sondmatning, colonization profilen för probiotiska spårades med kvantitativa polymeraskedjereaktion (qPCR) av extraherade intestinal DNA med LP specifika primers. Annan kull inställningar och bur tekniker användes att bedöma potentialen för colonization-spread. Protokollet Detaljer krångligheter av IE neonatal mus sondmatning och efterföljande kolonisering kvantifiering med LP.
Hos spädbarn, har tidig probiotiska exponering associerats med immunmodulerande effekter leder till minskad förekomst av sjukdomar som nekrotiserande enterokolit, atopisk dermatit och sepsis1,2,3, 4 , 5. men mekanismen bakom detta immunmodulerande svar är svårt för att utforska ges begränsningen till provtagning i nyfödda mänskliga försök (dvs. sekventiell blod dragningar och biopsier). Neonatal musmodeller kan hjälpa till att studera verkningsmekanismen inblandade i neonatal immunreglering associerade med probiotiska användning och ändringar i den intestinala bakterieflora. Tyvärr, de flesta musmodeller för probiotika har till stor del fokuserat på vuxna möss; effekten av probiotika är dock sannolikt att vara högsta tidigt i livet, vilket tyder på modeller som är specifika för denna åldersgrupp kommer att vara användbar3,6. Dessutom är neonatal musmodeller bättre lämpade att studera sjukdomar och ingripanden avsedda för tillämpning i tidiga liv mänskliga spädbarn som de förväntas att närmare efterlikna en utveckla immun och mikrobiella system7,8 ,9,10. Syftet var att undersöka omfattningen och mönster för probiotiska kolonisering av neonatala möss med fokus på den mekanistiska interaktionen mellan värden och dess mikrobiomet. Lämpliga beskrivningar av nyfödda modeller hittades inte i litteraturen, och således ett behov av utveckling av robusta och standardiserad metod var riktat.
Etablerade metoder för oral administrering av olika föreningar till nyfödda möss inkluderar mödra överföring av önskad föreningar genom mjölk genom att behandla vattenkällan för gravida dammar11 eller använda utfodring nålar för att underlätta administrering av önskad föreningar i orofarynx12. Dessa metoder är användbara för experiment som inte har krav på exakt dosering och där behandlingen är lätt intas av mottagarens musen. Probiotika är ofta administreras tillsammans med en prebiotiska såsom galactooligosaccharide och Fruktooligosackarid (FOS) som fungerar som en källa till näring för probiotiska bakterier; dessa additiva föreningar gör lösningen trögflytande och utmanande att administrera via ovan nämnda metoder. Utforma en metod för att administrera exakta mängder probiotika och prebiotika att nyfödda möss början så tidigt som den första dagen i livet (DOL) var nödvändigt. Håller på att utveckla den sondmatning tekniken, möjligheten till colonization-spread (som observerats i andra probiotiska studier mellan behandling och kontroll vapen13,14,15,16) testades och bedömdes det relativa överflödet av koloniserade Lactobacillus plantarum (LP) i tarmen av pups med olika sondmatning scheman. Probiotiska preparatet används i experimenten bestod av 109 kolonibildande enheter (CFU) per sondmatning av LP (ATCC-202195 stam), blandat med FOS (prebiotika) och maltodextrin (hjälpämne) som beskrivs i senaste mänskliga prov3. Probiotiska leveransen var fulländad använder IE sondmatning och processen är detaljerad i protokollet nedan. Colonization profilen för probiotiska utvärderades med hjälp realtid amplifiering av DNA extraheras från hela tarmen använder LP specifika primers.
Förfarandet för IE sondmatning utvecklades för att tryggt administrera en viss dos av probiotika till nyfödda möss. Små mängder vätska levereras till övre mag-tarmkanalen med hjälp av en utfodring nål för att förhindra aspiration samtidigt säkerställa leverans av doseringen i förtroende. Tarmarna av mössen samlades för kolonisering analys två och sex dagar efter sondmatning. Förfarandet för DNA-extraktion ändrades för att säkerställa hög avkastning av probiotiska grampositiva organismen. QPCR analys av DNA extraheras två dagar efter sista sondmatning visade relativt högre koloniseringen av LP i möss gavaged varannan dag i jämförelse med möss gavaged varje dag mellan DOL 2-8. Det fanns också en minskning av mängden LP under sex dagar, visar denna probiotiska vara en övergående organism i tarmarna av musen. Resultaten av dessa experiment fastställa villkoren för att bedriva forskning med hög noggrannhet i denna åldersgrupp.
För att Observera de långsiktiga effekterna av probiotika hos neonatala möss, administrerades det till neonatala möss på DOL 2; en liknande starttid peka på mänskliga rättegången. Orofaryngeal utfodring av neonatala möss tidigare beskrivs i litteraturen och har de genomförts först efter DOL 5-812,17 , när risken för aspiration är lägre på grund av en väl utvecklad svälja mekanik. Orofaryngeal utfodring är dock inte väl lämpade för DOL 2 möss som högre priser för aspiration observerades i pilotstudien (inga data anges). Den trögflytande karaktären av probiotika och prebiotika lösningen tillsätts risken för aspiration. Efter förfarandet för IE-gavaging minimeras risken för aspiration i DOL 2 möss samtidigt leverera önskad volym direkt till övre mag-tarmkanalen. Framgången för förfarandet validerades först använda karamellfärg infunderas probiotiska sondmatning. Karamellfärg fungerar som en markör som syns genom huden av pup. Inga negativa effekter observerades hos möss gavaged med karamellfärg, och det rekommenderas att validera gavaging förfarandet på detta sätt innan storskaliga experiment. Den snabb lösningen på den flämtande reflex sett inlägget sondmatning kan också användas som en ytterligare indikator för en framgångsrik sondmatning. När musen är placerat på den värme filten efter sondmatning, flämtande reflexen kommer att avta och en ökning av andning frekvensen kommer att observeras inom 20 sekunder. En fortsättning av den flämtande reflexen längre än 30 sekunder indikerar en misslyckad sondmatning. Framgångsrika sondmatning beror också på lämpliga införande av utfodring nålen med den lampa som sitter precis ovanför öppnandet av hjärt sphincter av magen. Detta kan underlättas genom att säkerställa att märkningen på nålen mäta längden mellan xiphoid processen och spetsen på nosen, inte går förbi nosen i musen under sondmatning. Detta minimerar risken för skador till musen. Frekvensen av sondmatning kan ha en betydande inverkan på experimentella resultat. Frekvent gavaging kan också skapa mer stress för ungarna och mamman på grund av ständig störning av buren och boet. Mest optimala sondmatning schemat är när gavages är den minst frekventa och över en kortare tidsperiod utan att förlora den förväntade effekten i systemet. För att garantera säkerhet och sterilitet av förfarandet sondmatning måste nål steriliseras genom tvätt och autoklavering däremellan användning. Tvätta noggrant på utsidan med en scrub och insidan genom att tvinga vattnet genom nålen med en spruta innan autoklavering behövs eventuella överblivna partiklar kan encrust på nålen under autoklavering och kan störa förfarandet för gavaging.
Högre LP colonization observerades på ungar som var gavaged varannan dag jämfört med valpar gavaged varje dag. Detta kan bero på minskad stress på valpar gavaged varannan dag och potentiellt den probiotiska får mer näringsämnen genom de relativt mer mjölk som intas av dessa valpar. Sambandet dos probiotisk behandling har tidigare studerats i mus modeller18,19 och således administrationen av rätt dos är viktigt. Den probiotiska lösning som beretts är klädd innan varje sondmatning att få korrekt antal CFU administreras. Om probiotiska organismen är anaerob, är det viktigt att se om det finns skillnad i CFU när odlade aerobt eller anaerobt. Eftersom LP är en fakultativt anaeroba, det var odlade hjälp av båda metoderna och ingen skillnad i CFU observerades.
Inlägget sondmatning intestinal LP belastning analysen utfördes med hjälp av qPCR och högkvalitativa DNA-prover. För att minimera LP DNA kontaminering mellan behandling och kontrollgrupperna, olika utfodring nålar, biosäkerhet skåp och kirurgisk utrustning användes för att garantera högsta kvalitet prover. Korrekt mätning av probiotiska i tarmen krävs en optimerad metod för DNA-extraktion. Mest effektiva metoder för extraktion av DNA från avföring innebär flera pärla slog steg20,21,22. Denna metod antogs för utvinning av tarmbakterier med pärla misshandeln och observerades minskad representation (< 102 exemplar återvinns) av LP i hela tarmen DNA extraktion. LP är en Gram-positiv organism med en betydande mängd peptidoglykan i cellväggen, optimerades protokollet med en peptidoglykan upplösning steg med hjälp av lysozym23,24 tillsätts den enzymatiska lyseringsbuffert. Detta ökade andelen LP i samma tarm prov med större än två gånger. Lysozym behandling garanterar upplösningen av det yttre lagret medan den pärla som slog steg underlättar lys av organismen. Optimering av mängden vävnad, vilken typ av granat pärla och varaktigheten av störningar med pärlorna är nödvändigt för att erhålla optimal DNA produkter för att utföra en PCR-analys.
Den positiva effekten av probiotika ges som profylax eller behandling i de pre- och sikt nyfödda framgår i senaste studier25,26,27,28. Inrättandet av en ordentlig neonatal musmodell för probiotika är befogad att packa upp den skyddande effekten av probiotika. Detta protokoll som beskrivs här representerar en guide för forskare som är obekanta med neonatal mus arbete med probiotika. Trots problem med gnagare bakterieflora medan du studerar människors hälsa och sjukdom, kan denna metod utvidgas till forskning inriktad på att förstå förändringarna av mikrobiomet på grund av probiotika. Denna modell ger också en plattform för att studera värd-mikrob interaktion och immunsvar under loppet av olika utvecklingsstadier.
The authors have nothing to disclose.
Tack vare Animal Care anläggning personal och UBC veterinärerna för att utbilda och bistå i musen fungerar på BC Children’s Hospital Research Institute. Tack till University of British Columbia och Institutionen för experimentell medicin för att finansiera studien.
1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |