Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie
Summary
Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung, Detektion und Identifizierung von diGly Peptiden, die aus ubiquitinierten Proteinen aus komplexen biologischen Proben stammen. Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar, robust und übertrifft die veröffentlichten Methoden in Bezug auf den Grad der Tiefe der Ubiquitinom-Analyse.
Abstract
Die posttranslationale Modifikation von Proteinen durch das kleine Protein Ubiquitin ist an vielen zellulären Ereignissen beteiligt. Nach der tryptischen Verdauung von ubiquitinierten Proteinen können Peptide mit einem Diglycin-Rest, die zur Epsilon-Aminogruppe von Lysin (‘K-‘-Diglycin’ oder einfach ‘diGly’) konjugiert sind, verwendet werden, um die ursprüngliche Modifikationsstelle zurückzuverfolgen. Effiziente Immunreinigung von diGly-Peptiden in Kombination mit sensiblem Nachweis durch Massenspektrometrie hat zu einem enormen Anstieg der Anzahl der bis heute identifizierten Ubiquitinationsstellen geführt. Wir haben einige Verbesserungen an diesem Workflow vorgenommen, einschließlich der Offline-Hoch-pH-Reverse-Phase-Fraktionierung von Peptiden vor dem Anreicherungsverfahren und der Einbeziehung erweiterter Peptidfragmentierungseinstellungen in den Ionen-Routing-Multipol. Außerdem führt eine effizientere Bereinigung der Probe mit einem filterbasierten Stecker, um die Antikörperperlen zu erhalten, zu einer größeren Spezifität für diGly-Peptide. Diese Verbesserungen führen zum routinemäßigen Nachweis von mehr als 23.000 diGly Peptiden aus menschlichen Gebärmutterhalskrebszellen (HeLa) Zelllysate bei Proteasomenhemmung in der Zelle. Wir zeigen die Wirksamkeit dieser Strategie für die eingehende Analyse der Ubiquitinom-Profile verschiedener Zelltypen und von In-vivo-Proben, wie z. B. Hirngewebe. Diese Studie präsentiert eine originelle Ergänzung der Toolbox für die Protein-Ubiquitinationsanalyse, um das tiefe zelluläre Ubiquitinom aufzudecken.
Introduction
Die Konjugation von Ubiquitin zu Proteinen kennzeichnet sie für den Abbau durch das Proteasom und ist ein entscheidender Prozess bei der Proteostase. Die C-Terminal-Carboxylgruppe von Ubiquitin bildet eine Isopeptidbindung mit der Lysin-Amino-Gruppe des Zielproteins1,2. Darüber hinaus kann Ubiquitin an andere Ubiquitin-Module angeschlossen werden, was zur Bildung homogener (d.h. K48 oder K11) oder verzweigter (d.h. heterogener oder gemischter) Polyubiquitinstrukturen1,3führt. Die bekannteste Funktion von Ubiquitin ist seine Rolle bei der proteasomalen Degradation, vermittelt durch K48-verknüpftes Polyubiquitin. Es ist jedoch klar geworden, dass sowohl Mono- als auch Polyubiquitination in vielen Prozessen eine Rolle spielen, die unabhängig von der Degradierung durch das Proteasom sind. Zum Beispiel haben K63-verknüpfte Ketten nicht abbauende Rollen im intrazellulären Handel, lysosomale Degradation, Kinase-Signalisierung und die Reaktion auf DNA-Schäden4,5. Die anderen sechs Verknüpfungstypen sind weniger häufig und ihre Rollen sind immer noch weitgehend rätselhaft, obwohl erste Hinweise auf ihre Funktionen in der Zelle entstehen, vor allem aufgrund der Entwicklung neuer Werkzeuge, um eine linkagespezifische Erkennung zu ermöglichen6,7.
Die Massenspektrometrie ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug für Proteomanalysen geworden und heutzutage können Tausende verschiedener Proteine aus praktisch jeder biologischen Quelle in einem einzigen Experiment identifiziert werden. Eine zusätzliche Komplexitätsschicht wird durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Proteinen (z. B. Phosphorylierung, Methylierung, Acetylierung und Ubiquitination) dargestellt, die die Proteinaktivität modulieren können. Die großflächige Identifizierung von PTM-haltigen Proteinen wurde auch durch Entwicklungen im Bereich der Massenspektrometrie ermöglicht. Die im Vergleich zu ihren unveränderten Gegenstücken relativ geringe Stoichiometrie von Peptiden mit PTMs stellt eine technische Herausforderung dar, und biochemische Anreicherungsschritte sind im Allgemeinen vor der Massenspektrometrieanalyse notwendig. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden verschiedene spezifische Anreicherungsmethoden für die Analyse von PTM entwickelt.
Aufgrund der vielfältigen Rolle der Protein-Ubiquitination in der Zelle besteht eine große Nachfrage nach der Entwicklung von Analysemethoden für den Nachweis von Ubiquitinationsstellen auf Proteinen8. Die Anwendung von massenspektrometrischen Methoden hat zu einer Explosion der Anzahl der identifizierten Ubiquitinationsstellen in Fruchtfliegen-, Maus-, Human- und Hefeproteinen9,10,11,12,13,14geführt. Ein wichtiger Schritt wurde durch die Entwicklung von immunititizipationsbasierten Anreicherungsstrategien auf Peptidebene unter Verwendung von Antikörpern gegen das Restmotiv K-A-GG (auch als “Diglycin” oder “diGly” bezeichnet) dargestellt. Diese diGly Peptide werden bei der Verdauung von ubiquitinierten Proteinen mit Trypsin als Protease15,16produziert.
Hier präsentieren wir einen optimierten Workflow zur Anreicherung von diGly-Peptiden mittels Immunreinigung und anschließender Detektion durch Orbitrap-Massenspektrometrie. Mit einer Kombination mehrerer Modifikationen bestehender Arbeitsabläufe, insbesondere in den Phasen der Probenvorbereitung und Massenspektrometrie, können wir nun routinemäßig mehr als 23.000 diGly-Peptide aus einer einzigen Probe von HeLa-Zellen identifizieren, die mit einem Proteasom behandelt wurden. Inhibitor und 10.000 US-Us-Us-Euro aus unbehandelten HeLa-Zellen. Wir haben dieses Protokoll auf Lysate sowohl aus unbeschrifteten als auch aus stabilen Isotopenkennzeichnungen mit Aminosäuren in der Zellkultur (SILAC) mit HeLa-Kennzeichnung sowie auf endogene Proben wie Hirngewebe angewendet.
Dieser Workflow stellt eine wertvolle Ergänzung zum Repertoire an Werkzeugen für die Analyse von Ubiquitinationsseiten dar, um das tiefe Ubiquitinom aufzudecken. Das folgende Protokoll beschreibt alle Schritte des Workflows im Detail.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll wurde auf Proben aus verschiedenen biologischen Quellen angewendet, wie z. B. kultivierte Zellen und In-vivo-Gewebe. In allen Fällen identifizierten wir Tausende von DIGly-Peptiden, vorausgesetzt, dass die Gesamteinmenge des Proteineinsatzes mindestens 1 mg betrug. Die Anreicherung mit spezifischen Antikörpern ist hocheffizient, da höchstens 100-150 sehr geringe diGly-Peptide aus ganzen Zelllysaten identifiziert wurden, wenn keine Anreicherungsverfahren für ubiquitinierte Proteine oder…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit ist Teil des Projekts “Proteins at Work”, einem Programm des Niederländischen Proteomics Centre, das von der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) im Rahmen der Nationalen Roadmap-Großforschungseinrichtungen (Projektnummer 184.032.201) finanziert wird. ).
Materials
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
Referências
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