पेप्टाइड संवर्धन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन सर्वव्यापकता साइटों का पता लगाना
Summary
हम जटिल जैविक नमूनों से सर्वव्यापी प्रोटीन से उत्पन्न होने वाले डिग्ली पेप्टाइड्स की शुद्धि, पता लगाने और पहचान के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। प्रस्तुत विधि सर्वव्यापकविश्लेषण की गहराई के स्तर के संबंध में प्रकाशित तरीकों को पुन: उत्पन्न, मजबूत और बेहतर प्रदर्शन करती है।
Abstract
छोटे प्रोटीन सर्वव्यापकता द्वारा प्रोटीन का पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन कई सेलुलर घटनाओं में शामिल है। सर्वव्यापी प्रोटीन के ट्रिप्टिक पाचन के बाद, एक डिग्लिसिन अवशेष के साथ पेप्टाइड्स का उपयोग लिसिन (‘K-ε-डिग्लिसिन’ या बस ‘डिग्ली’ के एपिलिन अमीनो समूह में किया जाता है) मूल संशोधन साइट को वापस ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा संवेदनशील पता लगाने के साथ संयुक्त डिग्ली पेप्टाइड्स के कुशल इम्यूनोशुद्धि के परिणामस्वरूप आज तक पहचाने गए सर्वव्यापी स्थलों की संख्या में भारी वृद्धि हुई है। हमने इस कार्यप्रवाह में कई सुधार किए हैं, जिनमें संवर्धन प्रक्रिया से पहले पेप्टाइड्स का ऑफलाइन उच्च पीएच रिवर्स-चरण अंशीकरण और आयन राउटिंग मल्टीपोल में अधिक उन्नत पेप्टाइड विखंडन सेटिंग्स को शामिल करना शामिल है। इसके अलावा, फिल्टर-आधारित प्लग का उपयोग करके नमूने की अधिक कुशल सफाई, एंटीबॉडी मोतियों को बनाए रखने के लिए डिग्ली पेप्टाइड्स के लिए अधिक विशिष्टता में परिणाम देता है। इन सुधारों के परिणामस्वरूप कोशिका में प्रोटेको अवरोध पर मानव गर्भाशय ग्रीवा कैंसर कोशिकाओं (HeLa) कोशिका से 23,000 से अधिक डिग्ली पेप्टाइड्स का नियमित पता लगाया जाता है। हम मस्तिष्क के ऊतकों जैसे कई अलग-अलग कोशिका प्रकारों और वीवो नमूनों में सर्वव्यापकता प्रोफाइल के गहन विश्लेषण के लिए इस रणनीति की प्रभावकारिता दिखाते हैं। यह अध्ययन गहरे सेलुलर सर्वव्यापकता को उजागर करने के लिए प्रोटीन सर्वव्यापकता विश्लेषण के लिए टूलबॉक्स के लिए एक मूल अतिरिक्त प्रस्तुत करता है।
Introduction
प्रोटीन के लिए सर्वव्यापकता का संयोजन उन्हें प्रोटेसोम द्वारा गिरावट के लिए चिह्नित करता है और प्रोटेओस्टेसिस में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। सर्वव्यापकता का सी-टर्मिनल कार्बोसिल समूह लक्ष्य प्रोटीन1,2के लाइसिन ε-अमीनो समूह के साथ एक आइसोपेप्टाइड बांड बनाता है। इसके अलावा, सर्वव्यापी अन्य सर्वव्यापी मॉड्यूल से जुड़ा हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप सजातीय (यानी, के48 या के11) या शाखाओं में बंटी (यानी, विषम या मिश्रित) पॉलीयूबिकिन संरचनाएं1,,3। सर्वव्यापकता का सबसे प्रसिद्ध कार्य प्रोटेसोमल क्षरण में इसकी भूमिका है, जो K48-जुड़े पॉलीयूक्विटिन द्वारा मध्यस्थता की गई है। हालांकि, यह स्पष्ट हो गया है कि मोनो के साथ-साथ पॉलीयूब्किटिनेशन दोनों भी कई प्रक्रियाओं में भूमिकानिभाते हैं जो प्रोटेसोम द्वारा गिरावट से स्वतंत्र हैं। उदाहरण के लिए, K63 से जुड़ी जंजीरों में इंट्रासेलर तस्करी, lysosomal क्षरण, काइनेज सिग्नलिंग और डीएनए क्षति प्रतिक्रिया4,,5में अडिग्रेडेटिव भूमिकाएं होती हैं । अन्य छह लिंकेज प्रकार कम प्रचुर मात्रा में हैं और उनकी भूमिकाएं अभी भी काफी हद तक रहस्यपूर्ण हैं, हालांकि सेल में उनके कार्यों के बारे में पहले संकेत उभर रहे हैं, मुख्यतः लिंकेज-विशिष्ट पहचान6,,7को सक्षम करने के लिए उपन्यास उपकरणों के विकास के कारण।
मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटेम विश्लेषण के लिए एक अनिवार्य उपकरण बन गया है और आजकल लगभग किसी भी जैविक स्रोत से हजारों विभिन्न प्रोटीन ों की पहचान एक ही प्रयोग में की जा सकती है। जटिलता की एक अतिरिक्त परत प्रोटीन (जैसे, फॉस्फोरिलाइजेशन, मिथाइलेशन, एसीटिलेशन, और सर्वव्यापकता) के पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएमएस) द्वारा प्रस्तुत की जाती है जो प्रोटीन गतिविधि को मिला सकती है। बड़े पैमाने पर पीटीएम-असर प्रोटीन की पहचान भी बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री क्षेत्र में विकास से संभव हो पाया है । अपने असंशोधित समकक्षों की तुलना में पीटीएमएस वाले पेप्टाइड्स की अपेक्षाकृत कम स्टोइचियोमेट्री एक तकनीकी चुनौती प्रस्तुत करती है और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पहले जैव रासायनिक संवर्धन कदम आम तौर पर आवश्यक होते हैं। पिछले दो दशकों में पीटीएमएस के विश्लेषण के लिए कई अलग-अलग विशिष्ट संवर्धन विधियां विकसित की गई हैं।
कोशिका में प्रोटीन सर्वव्यापकता की बहुआयामी भूमिकाओं के कारण, प्रोटीन8पर सर्वव्यापकता साइटों का पता लगाने के लिए विश्लेषणात्मक तरीकों के विकास की काफी मांग है। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक तरीकों के अनुप्रयोग के कारण फल मक्खी, माउस, मानव और खमीर प्रोटीन9, 10,,11,,12,,13,,14में पहचाने गए सर्वव्यापकता स्थलों की संख्या में विस्फोट हुआ है ।10 कश्मीर-ε-GG अवशेष आकृति के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग करपेटाइड स्तर पर इम्यूनोप्रिसिप्रिशन आधारित संवर्धन रणनीतियों के विकास द्वारा एक बड़ा कदम प्रस्तुत किया गया था (जिसे ‘डिग्लिसिन’ या ‘डिग्ली’ भी कहा जाता है)। ये डिग्ली पेप्टाइड्स ऑप्सिन का उपयोग करके सर्वव्यापी प्रोटीन के पाचन पर उत्पन्न होते हैं , जो15,16 को प्रोटीज के रूप में उपयोगकरतेहैं ।
यहां, हम ऑर्बिटरैप मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा इम्यूनोशुद्धि और बाद में पता लगाने का उपयोग करके डिग्ली पेप्टाइड्स के लिए समृद्ध करने के लिए एक अनुकूलित कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं। विशेष रूप से नमूना तैयारी और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री चरणों में मौजूदा वर्कफ़्लो के कई संशोधनों के संयोजन का उपयोग करके, अब हम नियमित रूप से प्रोटेसोम के साथ इलाज किए गए वाघेला कोशिकाओं के एक नमूने से 23,000 से अधिक डिग्ली पेप्टाइड्स की पहचान कर सकते हैं अवरोधक और अनुपचारित हेला कोशिकाओं से ~ 10,000। हमने सेल कल्चर (SILAC) में अमीनो एसिड के साथ अवेलेबल और स्थिर आइसोटोप लेबलिंग दोनों से लाइसेट्स के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू किया है, साथ ही मस्तिष्क के ऊतकों जैसे एंडोजेनस नमूनों के लिए भी।
यह कार्यप्रवाह सर्वव्यापी साइटों के विश्लेषण के लिए उपकरणों के प्रदर्शनों की सूची के लिए एक मूल्यवान इसके अतिरिक्त प्रस्तुत करता है ताकि गहरी सर्वव्यापकता को उजागर किया जा सके। निम्नलिखित प्रोटोकॉल कार्यप्रवाह के सभी चरणों का विस्तार से वर्णन करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल विभिन्न जैविक स्रोतों, जैसे सुसंस्कृत कोशिकाओं और वीवो ऊतक में नमूनों पर लागू किया गया था । सभी मामलों में हमने हजारों डिग्ली पेप्टाइड्स की पहचान की, बशर्ते कि कुल प्रोटीन इनपुट …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम परियोजना “काम पर प्रोटीन” का हिस्सा है, नीदरलैंड प्रोटेओमिक्स सेंटर के एक कार्यक्रम के राष्ट्रीय रोडमैप बड़े पैमाने पर अनुसंधान सुविधाओं (परियोजना संख्या १८४.०३२.२०१ के भाग के रूप में वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO) द्वारा वित्त पोषित ).
Materials
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
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