펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출
Summary
우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.
Abstract
작은 단백질 유비퀴틴에 의한 단백질의 번역 후 변형은 많은 세포 이벤트에서 관여한다. 유비퀴틴화된 단백질의 트리펩티드 소화 후, 리신의 엡실론 아미노 그룹(‘K-θ-디글리신’ 또는 단순히 ‘diGly’)에 컨쥬게이징된 디글리신 잔재를 함유한 펩티드를 원래의 수정 부위를 추적하는데 사용할 수 있다. 질량 분석법에 의한 민감한 검출과 결합된 diGly 펩티드의 효율적인 면역정화는 현재까지 확인된 유비퀴틴화 부위의 수가 크게 증가하였다. 우리는 농축 절차 이전에 펩타이드의 오프라인 높은 pH 역상 분획및 이온 라우팅 멀티폴에 보다 진보된 펩티드 단편화 설정을 포함하는 이 워크플로우를 몇 가지 개선했습니다. 또한, 항체 비드를 보유하기 위해 필터 기반 플러그를 사용하여 시료를 보다 효율적으로 정리하면 diGly 펩티드에 대한 더 큰 특이성을 초래한다. 이러한 개선은 인간 자궁 경부암 세포 (HeLa) 세포에서 23,000 개 이상의 diGly 펩티드의 일상적인 검출을 초래하여 세포에서 프로테아좀 억제에 따라 용해됩니다. 우리는 몇몇 다른 세포 모형및 두뇌 조직과 같은 생체 내 견본의 보편성 프로파일의 심층 분석을 위한 이 전략의 효험을 보여줍니다. 이 연구는 깊은 세포 유비퀴티노메를 밝히기 위해 단백질 유비퀴틴 분석을 위한 도구 상자에 원래 추가된 것을 제시합니다.
Introduction
단백질에 유비퀴틴의 융합은 프로테아솜에 의한 분해를 표시하고 프로테오스타증에서 중요한 과정입니다. 유비퀴틴의 C 말단 카르복실 그룹은 표적 단백질1,,2의리신 θ-아미노 기와 이소펩티드 결합을 형성한다. 또한, 유비퀴틴은 다른 유비퀴틴 모듈에 부착될 수 있으며, 이로 인해 균질한(즉, K48 또는 K11) 또는 분기(즉, 이질성 또는 혼합) 폴리유비퀴틴구조1,,3의형성을 초래한다. 유비퀴틴의 가장 잘 알려진 기능은 K48 연결 폴리유비퀴틴에 의해 매개된 프로테소말 분해에서의 역할입니다. 그러나, 모노-뿐만 아니라 polyubiquitination 또한 proteasome에 의한 분해와 무관하게 많은 프로세스에서 역할을 한다는 것이 분명해졌습니다. 예를 들어, K63 연결 체인은 세포 내 인신 매매, 리소좀 분해, 키나아제 신호 및 DNA 손상 반응4,,5에서비분해적 역할을 합니다. 다른 6개의 연계 유형은 덜 풍부하고 그들의 역할은 여전히 대체로 수수께끼이지만, 세포에서의 기능에 대한 첫 번째 징후가 나타나고 있지만, 주로 링크지 별검출을가능하게하는 새로운 도구의 개발로 인해 6,7.
질량 분석법은 프로테오메 분석을 위한 필수 도구가 되었으며, 오늘날 거의 모든 생물학적 공급원으로부터 수천 개의 다른 단백질이 단일 실험에서 확인될 수 있습니다. 복잡성의 추가 층은 단백질 활동을 조절할 수 있는 단백질의 번역 후 수정 (PTM)에 의해 제시됩니다 (예를 들어, 인산화, 메틸화, 아세틸화 및 유비퀴틴화). PTM 베어링 단백질의 대규모 식별은 질량 분석 분야의 개발에 의해 가능하게 되었습니다. PTM을 함유하는 펩티드의 상대적으로 낮은 화학적 분석은 수정되지 않은 펩티드에 비해 기술적 과제를 제시하며, 질량 분석 분석 이전에 는 생화학적 농축 단계가 일반적으로 필요하다. 지난 2년 동안 PTM 분석을 위해 여러 가지 특정 농축 방법이 개발되었습니다.
세포에서 단백질 유비퀴틴화의 다각적인 역할 때문에, 단백질 에 대한 유비퀴틴화 부위의 검출을 위한 분석 방법의 개발에 대한 수요가 매우 크다8. 질량 분광 방법의 적용은 과일 플라이, 마우스, 인간 및 효모 단백질9,,10,,11,,12,,13,,14에서확인 된 유비퀴틴 화 부위의 수의 폭발로 이어졌다. 주요 단계는 K-θ-GG 잔여 모티프(‘디글리신’ 또는 ‘diGly’라고도 함)에 대한 항체를 사용하여 펩타이드 수준에서 면역 침전 기반 농축 전략의 개발에 의해 제시되었다. 이들 디글리 펩티드는 프로테아제15,,16으로서트립신을 사용하여 유비퀴틴화 단백질의 소화시 생산된다.
여기서, 우리는 Orbitrap 질량 분광법에 의한 면역 정화 및 후속 검출을 사용하여 diGly 펩티드를 풍부하게 하는 최적화된 워크플로우를 제시합니다. 특히 시료 전처리 및 질량 분석 단계에서 기존 워크플로우의 여러 변형을 조합하여 proteasome로 처리된 HeLa 세포의 단일 샘플에서 23,000개 이상의 diGly 펩타이드를 일상적으로 식별할 수 있습니다. 억제제 및 치료되지 않은 HeLa 세포로부터 ~10,000. 우리는 세포 배양에 있는 아미노산으로 표지되지 않은 안정한 동위원소 표지둘 다에서 용해하기 위하여 이 프로토콜을 적용했습니다 (SILAC) HeLa 세포를 표지하고 두뇌 조직과 같은 내인성 견본에.
이 워크플로우는 깊은 유비퀴티노메를 발견하기 위해 유비퀴틴 사이트를 분석하기 위한 도구의 레퍼토리에 귀중한 추가를 제공합니다. 다음 프로토콜은 워크플로의 모든 단계를 자세히 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 기재된 프로토콜은 배양된 세포 및 생체내 조직과 같은 다양한 생물학적 공급원으로부터의 샘플에 적용되었다. 모든 경우에 우리는 diGly 펩티드의 수천을 확인, 총 단백질 입력 량이 적어도 이었다는 것을 제공 1 mg. 특이적 항체를 이용한 농축은 유비퀴틴화 단백질 또는 diGly 펩티드에 대한 농축 절차가 적용되지 않은 경우 전체 세포 용해물에서 만 100-150 매우 낮은 풍부한 diGly 펩티드만이 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국가 로드맵 대규모 연구 시설 (프로젝트 번호 184.032.201)의 일환으로 네덜란드 과학 연구 기구 (NWO)에 의해 자금을 조달 네덜란드 Proteomics 센터의 프로그램 “직장에서 단백질”프로젝트의 일부입니다 ).
Materials
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
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