Detektion av protein ubiquitination platser av peptidanrikning och masspektrometri
Summary
Vi presenterar en metod för rening, detektion och identifiering av diGly peptider som härrör från ubiquitinated proteiner från komplexa biologiska prover. Den presenterade metoden är reproducerbar, robust och överträffar publicerade metoder med avseende på nivån på djupet av ubiquitinome analysen.
Abstract
Den posttranslationala modifieringen av proteiner av det lilla proteinet ubiquitin är involverad i många cellulära händelser. Efter tryptisk matsmältning av allestädes närvarande proteiner, peptider med en diglycine kvarleva konjugerade till epsilon aminosagruppen av lysin (“K-ε-diglycine” eller helt enkelt “diGly”) kan användas för att spåra tillbaka den ursprungliga modifieringsstället. Effektiv immunopurification av diGly peptider i kombination med känsliga detektion av masspektrometri har resulterat i en enorm ökning av antalet ubiquitination webbplatser identifieras aktuell. Vi har gjort flera förbättringar av detta arbetsflöde, inklusive offline hög pH omvänd fas fraktionering av peptider före anrikning förfarandet, och införandet av mer avancerade peptid fragmentering inställningar i jon routing multipole. Dessutom, effektivare sanering av provet med hjälp av en filterbaserad kontakt för att behålla antikroppar pärlor resulterar i en större specificitet för diGly peptider. Dessa förbättringar resulterar i rutinmässig upptäckt av mer än 23.000 diGly peptider från mänskliga livmoderhalscancer celler (HeLa) cell lysates vid proteasome hämning i cellen. Vi visar effekten av denna strategi för djupgående analys av ubiquitinome profiler av flera olika celltyper och in vivo prover, såsom hjärnvävnad. Denna studie presenterar ett original tillägg till verktygslådan för protein ubiquitination analys för att avslöja den djupa cellulära ubiquitinome.
Introduction
Konjugeringen av ubiquitin till proteiner markerar dem för nedbrytning av proteasom och är en avgörande process i proteostas. C-terminalkarboxylgruppen av ubiquitin bildar en isopeptidbindning med lysin ε-aminogruppen i målproteinet1,2. Dessutom kan allestädes närvarande fästas vid andra allestädes närvarande moduler, vilket resulterar i bildandet av homogena (dvs. K48 eller K11) eller grenade (dvs. heterogena eller blandade) polyubiquitinstrukturer1,3. Den mest kända funktionen av ubiquitin är dess roll i proteasomal nedbrytning, medierad av K48-länkade polyubiquitin. Det har dock blivit tydligt att både mono- och polyubiquitination också spelar roller i många processer som är oberoende av nedbrytning av proteasomen. Till exempel har K63-länkade kedjor icke-degradativa roller i intracellulär handel, lysosomal nedbrytning, kinassignalering och DNA-skadehantering4,5. De övriga sex kopplingstyperna är mindre rikliga och deras roller är fortfarande i stort sett gåtfulla, även om de första indikationerna om deras funktioner i cellen håller på att växa fram, till stor del på grund av utvecklingen av nya verktyg för att möjliggöra länkningsspecifik upptäckt6,7.
Masspektrometri har blivit ett oumbärligt verktyg för proteomanalyser och numera kan tusentals olika proteiner från praktiskt taget alla biologiska källor identifieras i ett enda experiment. Ett ytterligare komplext lager presenteras genom posttranslationala modifieringar (PTMs) av proteiner (t.ex. fosforylering, metylering, acetyleration och ubiquitination) som kan modulera proteinaktivitet. Storskalig identifiering av PTM-bärande proteiner har också möjliggjorts genom utvecklingen inom masspektrometriområdet. Den relativt låga stökiometrin hos peptider med PTMs jämfört med deras oförändrade motsvarigheter utgör en teknisk utmaning och biokemiska anrikningssteg är i allmänhet nödvändiga före masspektrometrianalysen. Under de senaste två decennierna har flera olika specifika anrikningsmetoder utvecklats för analys av PTMs.
På grund av de mångfacetterade rollerna av proteinubiquitination i cellen, det finns en stor efterfrågan på utveckling av analytiska metoder för detektion av allestädes närvarande platser på proteiner8. Tillämpningen av masspektrometriska metoder har lett till en explosion av antalet identifierade ubiquitination platser i fruktfluga, mus, människa och jäst proteiner9,,10,11,12,13,14. Ett viktigt steg presenterades genom utvecklingen av immunoprecipitation baserade anrikningsstrategier på peptidnivå med hjälp av antikroppar riktade mot K-ε-GG kvarleva motiv (även kallad “diglycin” eller “diGly”). Dessa diGly peptider produceras vid matsmältningen av ubiquitinerade proteiner med trypsin som proteas15,16.
Här presenterar vi ett optimerat arbetsflöde för att berika för diGly peptider med hjälp av immunopurification och efterföljande detektion av Orbitrap masspektrometri. Med hjälp av en kombination av flera ändringar av befintliga arbetsflöden, särskilt i provberedningen och masspektrometristadiet, kan vi nu rutinmässigt identifiera mer än 23 000 diGly peptider från ett enda prov av HeLa-celler som behandlats med en proteasom och ~10 000 från obehandlade HeLa-celler. Vi har tillämpat detta protokoll på lysates från både omärkta och stabila isotopmärkning med aminosyror i cellodling (SILAC) märkta HeLa-celler samt på endogena prover som hjärnvävnad.
Detta arbetsflöde presenterar ett värdefullt tillägg till repertoaren av verktyg för analys av allestädes närvarande platser för att avslöja den djupa ubiquitinome. I följande protokoll beskrivs alla steg i arbetsflödet i detalj.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här tillämpades på prover från olika biologiska källor, såsom odlade celler och in vivo vävnad. I alla fall identifierade vi tusentals diGly peptider, förutsatt att den totala proteintillförselen var minst 1 mg. Anrikningen med hjälp av specifika antikroppar är mycket effektiv, med tanke på att endast högst 100-150 mycket låga rikliga diGly peptider identifierades från hela cell lysates om inga anrikning förfaranden för ubiquitinated proteiner eller diGly peptider tillämpades. U…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete är en del av projektet “Proteins at Work”, ett program för Nederländerna Proteomics Centre finansierat av The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) som en del av National Roadmap Large-Scale Research Facilities (projektnummer 184.032.201 ).
Materials
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
Referências
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
- Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
- Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review – Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
- Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
- Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
- Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
- Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
- Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).
- Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
- Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
- Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
- Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
- Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
- Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
