Påvisning av protein ubiquitination nettsteder av peptid berikelse og masse spektrometri
Summary
Vi presenterer en metode for rensing, deteksjon og identifisering av diGly peptider som stammer fra ubiquitinerte proteiner fra komplekse biologiske prøver. Den presenterte metoden er reproduserbar, robust og overgår publiserte metoder med hensyn til dybdenivået i ubiquitinome-analysen.
Abstract
Den posttranslationale modifikasjonen av proteiner av det lille proteinet ubiquitin er involvert i mange cellulære hendelser. Etter tryptisk fordøyelse av ubiquitinerte proteiner, kan peptider med en diglycine rest konjugert til epsilon aminogruppen lysin (‘K-ε-diglycine’ eller bare ‘diGly’) brukes til å spore tilbake det opprinnelige modifikasjonsstedet. Effektiv immunrensing av diGly peptider kombinert med sensitiv deteksjon av massespektrometri har resultert i en stor økning i antall ubiquitination nettsteder identifisert oppdatert. Vi har gjort flere forbedringer i denne arbeidsflyten, inkludert offline høy pH omvendt fase fraksjon av peptider før berikelseprosedyren, og inkludering av mer avanserte peptidfragmenteringsinnstillinger i ionruting multipol. Også mer effektiv opprydding av prøven ved hjelp av en filterbasert plugg for å beholde antistoffperlene resulterer i en større spesifisitet for diGly peptider. Disse forbedringene resulterer i rutinemessig påvisning av mer enn 23.000 diGly peptider fra humane livmorhalskreftceller (HeLa) celle lysates på proteasome hemming i cellen. Vi viser effekten av denne strategien for grundig analyse av ubiquitinome profiler av flere forskjellige celletyper og in vivo prøver, for eksempel hjernevev. Denne studien presenterer et originalt tillegg til verktøykassen for proteinubiquitinasjonsanalyse for å avdekke den dype cellulære ubiquitinome.
Introduction
Bøyningen av ubiquitin til proteiner markerer dem for nedbrytning av proteasomen og er en avgjørende prosess i proteostase. C-terminal karboksylgruppen av ubiquitin danner et isopeptidbånd med lysin-ε-amino-gruppen avmålproteinet 1,2. I tillegg kan ubiquitin festes til andre ubiquitinmoduler, noe som resulterer i dannelse av homogene (dvs. K48 eller K11) eller forgrenet (dvs. heterogen eller blandet) polyubiquitinstrukturer1,3. Den mest kjente funksjonen til ubiquitin er dens rolle i proteasomal nedbrytning, mediert av K48-koblet polyubiquitin. Det har imidlertid blitt klart at både mono- så vel som polyubiquitination også spiller roller i mange prosesser som er uavhengige av nedbrytning av proteasom. For eksempel har K63-tilknyttede kjeder nondegradative roller i intracellulær handel, lysosomal nedbrytning, kinasesignalering og DNA-skaderespons4,5. De andre seks koblingstypene er mindre rikelig, og deres roller er fortsatt i stor grad gåtefulle, selv om de første indikasjonene på deres funksjoner i cellen dukker opp, hovedsakelig på grunn av utviklingen av nye verktøy for å muliggjøre koblingsspesifikk deteksjon6,7.
Massespektrometri har blitt et uunnværlig verktøy for proteomeanalyser, og i dag kan tusenvis av forskjellige proteiner fra nesten alle biologiske kilder identifiseres i et enkelt eksperiment. Et ekstra lag av kompleksitet presenteres ved posttranslational modifikasjoner (PTMs) av proteiner (f.eks fosforylering, metylering, acetylering og ubiquitination) som kan modulere proteinaktivitet. Storskala identifisering av PTM-bærende proteiner har også blitt gjort mulig av utviklingen i massespektrometrifeltet. Den relativt lave stoichiometry av peptider bærer PTMs sammenlignet med sine umodifiserte kolleger presenterer en teknisk utfordring og biokjemiskberikelse trinn er generelt nødvendig før massespektrometri analyse. I løpet av de siste to tiårene har flere ulike spesifikke berikelsesmetoder blitt utviklet for analyse av PTMs.
På grunn av de mangefasetterte rollene til proteinubiquitination i cellen, er det stor etterspørsel etter utvikling av analytiske metoder for påvisning av ubiquitination nettsteder på proteiner8. Anvendelsen av massespektrometriske metoder har ført til en eksplosjon av antall identifiserte ubiquitination nettsteder i frukt fly, mus, menneskelig, og gjær proteiner9,,10,11,12,13,14. Et stort skritt ble presentert ved utvikling av immunnedbørsbaserte berikelsesstrategier på peptidnivå ved hjelp av antistoffer rettet mot K-ε-GG restmotiv (også referert til som “diglycine” eller “diGly”). Disse diGly peptidene er produsert ved fordøyelsen av ubiquitinated proteiner ved hjelp av trypsin som protease15,16.
Her presenterer vi en optimalisert arbeidsflyt for å berike for diGly peptider ved hjelp av immunrensing og påfølgende deteksjon av Orbitrap massespektrometri. Ved hjelp av en kombinasjon av flere modifikasjoner av eksisterende arbeidsflyter, spesielt i prøvepreparatet og massespektrometristadiene, kan vi nå rutinemessig identifisere mer enn 23 000 diGly peptider fra en enkelt prøve av HeLa-celler behandlet med en proteasom hemmer og ~10 000 fra ubehandlede HeLa-celler. Vi har brukt denne protokollen til å lysates fra både umerkede og stabile isotop merking med aminosyrer i cellekultur (SILAC) merket HeLa celler samt til endogene prøver som hjernevev.
Denne arbeidsflyten presenterer et verdifullt tillegg til repertoar av verktøy for analyse av ubiquitination nettsteder for å avdekke den dype ubiquitinome. Følgende protokoll beskriver alle trinnene i arbeidsflyten i detalj.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen som er beskrevet her ble brukt på prøver fra ulike biologiske kilder, for eksempel kultiverte celler og in vivo vev. I alle tilfeller identifiserte vi tusenvis av diGly peptider, forutsatt at den totale proteininngangsmengden var minst 1 mg. Berikelsen ved hjelp av spesifikke antistoffer er svært effektiv, gitt at bare på det meste 100-150 svært lave rikelig diGly peptider ble identifisert fra hele celle lysates hvis ingen berikelse prosedyrer for ubiquitinated proteiner eller diGly peptider ble brukt. ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er en del av prosjektet “Proteiner på jobben”, et program fra Nederland Proteomics Centre finansiert av Nederlands organisasjon for vitenskapelig forskning (NWO) som en del av National Roadmap Large-Scale Research Facilities (prosjektnummer 184.032.201 ).
Materials
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
Referências
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
- Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
- Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review – Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
- Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
- Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
- Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
- Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
- Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).
- Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
- Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
- Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
- Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
- Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
- Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
