一种用自动表型分析预测线虫化学毒性的高通量测定
Summary
通过对线虫表型分析的自动分析, 提出了一种定量鉴别和预测化学品急性毒性的方法。该协议描述了如何在384孔板中使用化学物质处理蠕虫, 捕获视频, 并量化与毒理学相关的表型。
Abstract
对小鼠或大鼠等高阶生物中的化学品进行毒性测试是耗时和昂贵的, 因为它们的寿命长, 维护问题。相反, 线虫具有其优势, 使其成为毒性试验的理想选择: 寿命短、易于栽培、繁殖效率高。在这里, 我们描述了一个协议的自动表型分析的线虫在384孔板。线虫在384孔板中进行液体介质和化学处理, 并对每口井进行视频处理, 以量化化学对33种蠕虫特征的影响。实验结果表明, 量化的表型特征可以对不同化合物的急性毒性进行分类和预测, 并为啮齿类动物模型中的进一步传统化学毒性评价试验确定优先清单。
Introduction
随着化合物在工业生产和人们日常生活中的迅速发展, 研究这些化学品的毒性检测模型具有重要意义。在许多情况下, 使用啮齿类动物模型来评估不同化学品对健康的潜在毒性。一般来说, 在体内的啮齿类动物模型中, 确定致死浓度 (即不同化学品的50% 致死剂量 [ld50]) 被用作传统参数, 这既耗时又非常昂贵。此外, 由于减少、提炼或取代 (3r) 原则, 这对动物福利和伦理至关重要, 允许替换更高动物的新方法对科学研究有价值 1、2、3.线虫是一种自由生活的线虫, 已从土壤中分离出来。由于其寿命短、栽培方便、繁殖效率高等优点, 在实验室中得到了广泛的应用。此外, 许多基本的生物途径, 包括基本的生理过程和在线虫的应激反应,在高级哺乳动物4,5,6,7被保存,8. 在我们和其他人进行的几次比较中, 在啮齿类动物中观察到的线虫毒性和毒性之间有很好的一致性9。所有这些都使线虫成为测试体内化学毒性影响的良好模型。
近年来, 一些研究对线虫的表型特征进行了量化。这些特性可用于分析化学品 2、3、10 的毒性和蠕虫的老化11。我们还开发了一种结合液体蠕虫养殖系统和图像分析系统的方法, 在不同的化学处理下, 将蠕虫培养在384孔板中12。该定量技术已开发出来, 可在384孔板中进行12-24h 的化学处理后, 自动分析线虫的33个参数。采用自动显微镜级进行实验视频采集。这些视频由定制设计的程序处理, 与蠕虫移动行为相关的33个功能被量化。该方法用于对10种化合物的处理下的蠕虫表型进行量化。结果表明, 不同的毒性能改变线虫的表型。这些量化的表型可用于识别和预测不同化合物的急性毒性。该方法的总体目标是促进液体培养中线虫实验的观察和表型定量。该方法可用于化学毒性评价和表型定量, 有助于预测不同化合物的急性毒性, 并为进一步的传统化合物建立优先清单。啮齿类动物模型中的化学毒性评估试验。此外, 该方法还可作为食品添加剂污染、药理化合物、环境外源化合物等, 应用于新型化学品或化合物的毒性筛选和检测。
Protocol
Representative Results
Discussion
线虫的优点导致其在毒理学9中的应用越来越多, 无论是在机械研究还是高通量筛选方法。近年来, 线虫在补充其他毒理学研究模型系统方面的作用显著增加, 特别是在新化学品的快速毒性评估方面。本文为384井板蠕虫表型的高通量定量筛选提供了一种新的方法, 用于化学毒性的自动鉴定和评价。该检测方法是24小时内化学品急性毒性检测的理想选择, 可应用于亚急性毒…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢 cgc 善意地发送了线虫。这项工作得到了中国国家重点研究与发展计划 (#2018YFC1603102、#2018YFC1602705) 的支持;国家自然科学基金授予 (#31401025, #81273108, #81641184), 北京首都健康研究与开发专项项目 (#2011-1013-03), 北京环境毒理学重点实验室开放基金 (#2015 hjdl03), 中国山东省自然科学基金 (zr2017bf041)。
Materials
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 59300 | |
| 384-well plates | Throme | 142761 | |
| Agar | Bacto | 214010 | |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | PHL80892 | |
| Bleach buffer | 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water | ||
| Cadmium chloride | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | |
| CCD camera | Zeiss | AxioCam HRm | Zeiss microscopy GmbH |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma-Aldrich | 451657 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 24105 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| K-Medium | 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water | ||
| LB Broth | 10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| NGM Plate | 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer | ||
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60130 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 795496 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| PPB buffer | 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water | ||
| shaker | ZHICHENG | ZWY-200D | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | s7920 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 239305 | |
| The link of program | https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate | ||
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | |
| Zeiss automatic microscope | Zeiss | AXIO Observer.Z1 | Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera |
Referências
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