Un test haut débit pour la prévision de la toxicité chimique de profilage phénotypique automatisé de Caenorhabditis elegans
Summary
Une méthode quantitative a été développée pour identifier et prédire la toxicité aiguë de substances chimiques en analysant automatiquement la détermination des caractéristiques phénotypiques de Caenorhabditis elegans. Ce protocole décrit comment traiter les vers avec des produits chimiques dans une plaque 384 puits, capturer des vidéos et quantifier les phénotypes associés toxicologiques.
Abstract
Essais de toxicité des produits chimiques chez les organismes supérieurs de commande, tels que les souris ou les rats, l’application, c’est long et coûteux, en raison de leur longue durée de vie et les problèmes d’entretien. Au contraire, le nématode Caenorhabditis elegans (c. elegans) a des avantages à en font un choix idéal pour les essais de toxicité : une courte durée de vie, une culture facile et de reproduction efficace. Nous décrivons ici un protocole pour le profilage phénotypique automatique de c. elegans dans une plaque 384 puits. Les vers nématodes sont cultivées dans une plaque 384 puits avec traitement moyen et chimique liquides et vidéos sont prises de chaque puits de quantifier l’influence chimique sur 33 caractéristiques de ver. Les résultats expérimentaux montrent que les caractéristiques de phénotype chiffrés peuvent classer et prédire la toxicité aiguë pour les différents composés chimiques et établir une liste de priorités pour les tests d’évaluation plus traditionnelle de la toxicité chimique dans un modèle de rongeur.
Introduction
Avec le développement rapid des composés chimiques appliqués à la production industrielle et de la vie quotidienne du peuple, il est important d’étudier la toxicité à l’essai des modèles pour les produits chimiques. Dans de nombreux cas, le modèle animal rongeur est employé pour évaluer la toxicité potentielle des différents produits chimiques sur la santé. En règle générale, la détermination des concentrations létales (c.-à-d. la dosé 50 % dose létale [DL50] de différents produits chimiques) est utilisée comme paramètre dans un modèle de rongeur (rat/souris) in vivo, traditionnel qui est long et très coûteux. En outre, en raison de la réduire, affiner ou remplacer (3R) principe qui est au cœur de l’éthique et du bien-être animal, de nouvelles méthodes qui permettent le remplacement des animaux supérieurs sont précieux pour la recherche scientifique1,2,3 . C. elegans est un nématode libre qui a été isolé du sol. Il a été largement utilisé comme un organisme de recherche en laboratoire en raison de ses caractéristiques bénéfiques, notamment une courte durée de vie, une culture facile et de reproduction efficace. En outre, plusieurs voies biologiques fondamentaux, y compris les processus physiologiques de base et les réactions de stress chez c. elegans, sont conservées dans les mammifères supérieurs4,5,6,7 , 8. dans quelques comparaisons nous et autres avons fait, il y a une bonne concordance entre le c. elegans ou toxique observé chez les rongeurs,9. Tout cela fait c. elegans , un bon modèle pour tester les effets de la toxicité chimique in vivo.
Récemment, certaines études quantifié les caractéristiques phénotypiques de c. elegans. Les caractéristiques peuvent être utilisés pour analyser la toxicité des produits chimiques2,3,10 et le vieillissement vers11. Nous avons également développé une méthode qui combine un ver liquid culture système et un système d’analyse image, où les vers sont cultivées dans une plaque 384 puits sous différents traitements chimiques12. Cette technique quantitative a été développée pour analyser automatiquement les 33 paramètres de c. elegans après 12 à 24 heures de traitement chimique dans une plaque 384 puits avec un milieu liquide. Une platine du microscope automatisé est utilisé pour l’acquisition vidéo expérimentale. Les vidéos sont traitées par un programme sur-mesure, et 33 caractéristiques liées au comportement de déplacement du ver sont quantifiées. La méthode est utilisée pour quantifier les phénotypes de ver dans le traitement des 10 composés. Les résultats montrent que les différentes toxicités peuvent altérer les phénotypes de c. elegans. Ces phénotypes quantifiées peuvent être utilisés pour identifier et prédire la toxicité aiguë de différents composés chimiques. L’objectif général de cette méthode est de faciliter l’observation et la quantification phénotypique des expériences avec le c. elegans en milieu liquide. Cette méthode est utile pour l’application de c. elegans dans les évaluations de la toxicité chimique et analyses quantitatives phénotype, ce qui aident à prédire la toxicité aiguë de différents composés chimiques et établir une liste de priorités pour les plus traditionnels tests d’évaluation de la toxicité chimique dans un modèle de rongeur. En outre, cette méthode peut être appliquée à la toxicité de dépistage et de tester de nouveaux produits chimiques ou le composé comme la pollution agent additif alimentaire, composés de pharmacautical, environnement composé exogène et ainsi de suite.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les avantages de c. elegans ont conduit à son utilisation croissante en toxicologie9, tant pour les études mécanistiques et approches de criblage à haut débit. Un rôle accru pour le c. elegans en complément des autres systèmes de modèle dans la recherche toxicologique a été remarquable ces dernières années, en particulier pour l’évaluation de la toxicité rapide de nouveaux produits chimiques. Cet article fournit une nouvelle méthode de dosage de criblage haut d?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le CCG pour bien vouloir envoyer c. elegans. Ce travail a été soutenu par la National Key Research and Development Programme of China (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705) ; Fondation nationale des sciences naturelles de Chine Grant (#31401025, #81273108, #81641184), Capital Health recherche et développement d’un projet spécial à Pékin (#2011-1013-03), le fonds de l’ouverture du laboratoire de toxicologie de l’environnement (# clé Beijing 2015HJDL03) et la Fondation des sciences naturelles de la Province de Shandong, Chine (ZR2017BF041).
Materials
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 59300 | |
| 384-well plates | Throme | 142761 | |
| Agar | Bacto | 214010 | |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | PHL80892 | |
| Bleach buffer | 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water | ||
| Cadmium chloride | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | |
| CCD camera | Zeiss | AxioCam HRm | Zeiss microscopy GmbH |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma-Aldrich | 451657 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 24105 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| K-Medium | 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water | ||
| LB Broth | 10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| NGM Plate | 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer | ||
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60130 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 795496 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| PPB buffer | 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water | ||
| shaker | ZHICHENG | ZWY-200D | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | s7920 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 239305 | |
| The link of program | https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate | ||
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | |
| Zeiss automatic microscope | Zeiss | AXIO Observer.Z1 | Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera |
Referências
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