En høy gjennomstrømming analysen for prediksjon av kjemiske giftighet av automatisert fenotypiske profilering av Caenorhabditis elegans

Summary

Kvantitativ metode er utviklet for å identifisere og forutsi Akutt toksisitet av kjemikalier ved å automatisk analysere fenotypiske profilering av Caenorhabditis elegans. Denne protokollen beskriver hvordan å behandle ormer med kjemikalier i en 384-vel plate, fange video og kvantifisere toksikologiske relaterte fenotyper.

Abstract

Bruk toksisitet testing av kjemikalier i høyere orden organismer, som mus eller rotter, er tidkrevende og kostbar, deres lang levetid og vedlikeholdsproblemer. Tvert imot, Rundormer Caenorhabditis elegans (C. elegans) har fordeler å gjøre det et ideelt valg for toksisitet testing: en kort levetid, lett dyrking og effektiv gjengivelse. Her beskriver vi en protokoll for automatisk fenotypiske profilering C. elegans i en 384-vel plate. Rundormer ormer er kultivert i en 384-vel plate med flytende medium og kjemisk behandling, og videoer er tatt av hver brønn å kvantifisere kjemiske påvirkning på 33 ormen funksjoner. Eksperimentelle resultater viser at funksjonene kvantifisert fenotypen kan klassifisere og forutsi Akutt toksisitet for ulike kjemiske forbindelser og opprette en prioritet for mer tradisjonelle kjemiske giftighet vurdering tester i en gnager modell.

Introduction

Sammen med den raske utviklingen av kjemiske forbindelser på industriell produksjon og folks daglige liv, er det viktig å studere toksisitet testing modeller for kjemikalier. I mange tilfeller er den gnager dyremodell ansatt å vurdere den potensielle toksisitet av ulike kjemikalier på helse. Vanligvis er bestemmelse av dødelige konsentrasjoner (dvs. assayed 50% dødelig dose [LD50] ulike kjemikalier) brukt som tradisjonelle parameteren i en gnager (rotte/mus) modell i vivo, som er tidkrevende og svært dyre. Dessuten, på grunn av redusere, avgrense eller erstatte (3R) prinsipp som er sentrale for dyrevelferd og etikk, nye metoder som tillater utskifting av dyr er verdifulle forskning^1,2,3 . C. elegans er et frittlevende Rundormer som er isolert fra jord. Det har vært mye brukt som en forskning organisme i laboratoriet på grunn av sin fordelaktige egenskaper, som kort lifespan, lett dyrking og effektiv gjengivelse. I tillegg er mange grunnleggende biologiske banene, inkludert grunnleggende fysiologiske prosesser og stressresponser i C. elegans, bevart i høyere pattedyr^{4,5,6,7 , 8}. et par sammenligninger vi og andre har gjort, det er en god samsvar mellom C. elegans giftighet og toksisitet i gnagere⁹. Alt dette gjør C. elegans en god modell for å teste effekten av kjemiske toksisitet i vivo.

Nylig kvantifisert noen studier fenotypiske funksjonene C.elegans. Funksjonene kan brukes å analysere toksisitet av kjemikalier^2,3,10 og aldring av ormer¹¹. Vi har også utviklet en metode som kombinerer en flytende orm dyrking og et bilde analyse systemet, der ormer er kultivert i en 384-vel plate under forskjellige kjemiske behandlinger¹². Dette kvantitativ teknikk er utviklet for å automatisk analysere 33 parameterne C. elegans etter 12-24h kjemisk behandling i en 384-vel plate med flytende medium. En automatisert mikroskop scenen brukes for eksperimentelle video oppkjøpet. Videoene er behandlet av en tilpasset designet program og 33 funksjoner for ormer flytte atferd er kvantifisert. Metoden er brukt om å kvantifisere av ormen fenotyper under behandling av 10 forbindelser. Resultatene viser at ulike toksisitet kan endre av fenotyper C.elegans. Disse kvantifisert fenotyper kan brukes til å identifisere og forutsi Akutt toksisitet av ulike kjemiske forbindelser. Det overordnede målet med denne metoden er å tilrettelegge for observasjon og fenotypiske kvantifisering eksperimenter med C. elegans i en. Denne metoden er nyttig for programmet C. elegans kjemiske giftighet evalueringer og fenotypen quantifications, som hjelper forutse Akutt toksisitet av ulike kjemiske forbindelser og opprette en prioritet for mer tradisjonelle kjemiske giftighet vurdering tester i en gnager modell. I tillegg kan denne metoden brukes toksisitet screening og testing av nye kjemikalier eller sammensatte som mat additiv agent forurensning, pharmacautical forbindelser, miljømessige eksogene sammensatte og så videre.

Protocol

Protokollen følger retningslinjene som dyr pleie av dyr etikk Beijing sentrum for sykdomsforebygging og kontroll i Kina. 1. kjemisk forberedelse Få kjemikalier (tabell 1 og Tabell for materiale). Angi høyeste og laveste dosering av personlige kjemikalier for en minimum konsentrasjon av 100% dødelighet (LC100, 24 h) og en maksimal konsentrasjon av 100% nonlethality (LC0, 24 h) til ormer. Bruk minst seks fortynninger av den høyeste konse…

Representative Results

Vi har testet av fenotyper ormer utsatt for ulike konsentrasjoner av mer enn 10 kjemikalier12. I testen kvantifisert 33 forskjellige funksjoner for hver kjemisk ved tre tidspunkt (0 h, 12t og 24 h). En sammenligning mellom en håndbok og en automatisk analyse av en levetid analysen var tidligere gjort11,12. I denne analysen fant vi at kjemikalier og konsentrasjoner kan påvirke av ormen fenotyper. En oversi…

Discussion

Fordelene med C. elegans har ført til økende bruk i toksikologi⁹, både mekanistisk studier og høy gjennomstrømming screening tilnærminger. En øket rolle for C. elegans i utfyller andre modellsystemer i toksikologiske forskning har vært bemerkelsesverdig de siste årene, spesielt for rask toksisitet vurdering av nye kjemikalier. Denne artikkelen inneholder en ny analysen av høy gjennomstrømning og kvantitative screening av ormen fenotyper i en 384-vel plate for automatis…

Materials

2-Propanol	Sigma-Aldrich	59300
384-well plates	Throme	142761
Agar	Bacto	214010
Atropine sulfate	Sigma-Aldrich	PHL80892
Bleach buffer			0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride	Sigma-Aldrich	202908
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	21074
CCD camera	Zeiss	AxioCam HRm	Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Copper(II) sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Ethanol	Sigma-Aldrich	24105
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
K-Medium			3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth			10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	63140
NGM Plate			3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone	Bacto	211677
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	60130
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	795488
PPB buffer			35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker	ZHICHENG	ZWY-200D
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	71382
Sodium fluoride	Sigma-Aldrich	s7920
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	239305
The link of program			https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625
Zeiss automatic microscope	Zeiss	AXIO Observer.Z1	Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera