Manipulación de la función del Gene en mexicano Cavefish
Summary
Se describen métodos para la manipulación de genes en el sistema del modelo evolutivo Astyanax mexicanus. Se describen tres técnicas diferentes: transgénesis mediada de Tol2, manipulación dirigida del genoma utilizando CRISPR/Cas9 y caída de expresión usando morfolinos. Estas herramientas deben facilitar la investigación directa de los genes subyacentes a la variación entre las formas de la superficie y cavernas.
Abstract
Cueva de animales proporcionan un sistema convincente para la investigación de los mecanismos evolutivos y bases genéticas subyacen cambios en numerosos rasgos complejos, incluyendo degeneración de ojo, albinismo, pérdida de sueño, hiperfagia y procesamiento sensorial. Especies de cavefish de todo el mundo muestran una evolución convergente de rasgos morfológicos y de comportamiento debido a las presiones ambientales compartidos entre sistemas de diferentes cuevas. Cueva de diversas especies se han estudiado en el entorno de laboratorio. El tetra mexicano, Astyanax mexicanus, con formas visuales y ciegas, ha proporcionado perspectivas únicas en los procesos biológicos y moleculares subyacentes a la evolución de rasgos complejos y es bien posicionado como un sistema modelo emergente. Mientras que genes candidatos que regulan la evolución de diversos procesos biológicos han sido identificados en a. mexicanus, ha limitado la capacidad de validar una función de los genes individuales. La aplicación de la transgénesis y la tecnología de edición de gen tiene el potencial para superar este impedimento significativo e investigar los mecanismos subyacentes a la evolución de características complejas. Aquí, describimos una metodología diferente para manipular genes en a. mexicanus. Los enfoques incluyen el uso de morfolinos, transgénesis de Tol2 , y modelos de sistemas de edición génica, usadas en pez cebra y otros peces, para manipular funciones de los genes en a. mexicanus. Estos protocolos incluyen descripciones detalladas de los procedimientos de reproducción programada, la colección de huevos fecundados, las inyecciones y la selección de animales genéticamente modificados. Permitirán a estos enfoques metodológicos para la investigación de los mecanismos genéticos y de los nervios subyacentes a la evolución de diversos rasgos en a. mexicanus.
Introduction
Desde el Origen de las especiesde Darwin1, los científicos han adquirido profundas penetraciones en cómo están formados evolutivamente rasgos frente a las presiones ambientales y ecológicas definidas, gracias a la cueva de organismos2. El tetra mexicano, a. mexicanus, se compone de ojos ancestrales poblaciones ‘superficiales’ que habitan en ríos en México y sur de Texas y de al menos 29 poblaciones geográficamente aisladas de morfos derivados cueva que habitan en la Sierra del Abra y otras áreas del noreste de México3. Se han identificado una serie de rasgos asociados de cueva en a. mexicanus, incluyendo consumo alterado de oxígeno, despigmentación, pérdida de ojos y alteraciones de la alimentación y forraje comportamiento4,5,6, 7,8,9. A. mexicanus presenta un potente modelo para investigar mecanismos de evolución convergente debido a una historia evolutiva bien definida, una detallada caracterización del ambiente ecológico y la presencia de manera independiente desarrolló cueva las poblaciones de10,11. Muchos de los rasgos derivados de cueva que están presentes en cavefish, incluyendo la pérdida del ojo, pérdida de sueño, mayor alimentación, pérdida de la escolaridad, reducción la agresión y reducción las respuestas de estrés, han evolucionado varias veces a través de orígenes independientes, a menudo utilizando diferentes vías genéticas entre cuevas8,12,13,14,15. Esto repite la evolución es un aspecto de gran alcance del sistema a. mexicanus y puede proporcionar la penetración en la cuestión más general de sistemas como genéticos puede ser perturbado para generar fenotipos similares.
Mientras que la aplicación de la tecnología genética para la investigación mecanicista de la función del gene ha sido limitada en muchas especies de peces (incluyendo a. mexicanus), avances recientes en el pez cebra proporcionan una base para el desarrollo de la tecnología genética en peces 16,17,18,19,20. Numerosas herramientas son ampliamente utilizados en el pez cebra para manipular la expresión genética, y la aplicación de estos procedimientos se han estandarizado mucho. Por ejemplo, la inyección de morfolino oligos (MOs) en la etapa unicelular selectivamente bloquea RNA y evita la traducción de una breve ventana temporal durante el desarrollo de21,22. Además, enfoques gene-edición, tales como agrupadas regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) / CRISPR asociados proteína 9 (Cas9) y nucleasas efectoras como activador de transcripción (TALEN), permiten la generación de las canceladuras definidas o, en algunos casos, las inserciones a través de una recombinación en el genoma19,20,23,24. Transgénesis se usa para manipular la expresión génica estable o función de una manera específica de tipo celular. El sistema de Tol2 es utilizado con eficacia para generar animales transgénicos por coinjecting transposasa mRNA con un plásmido de DNA de Tol2 que contiene un transgen25,26. El sistema de Tol2 utiliza la transposasa de Tol2 de medaka generar del germline estable inserciones de construct17 transgénicos. Generación de Tol2 transgénicos implica coinjecting un plásmido que contiene un transgen flanqueado por sitios de integración Tol2 y mRNA para Tol2 transposasa17. Este sistema ha sido utilizado para generar una matriz de líneas transgénicas en el pez cebra y recientemente ha ampliado su uso a los sistemas adicionales del modelo emergente, incluyendo cichlids, killis, espinoso y, más recientemente, el mexicano cavefish27, 28,29,30.
Mientras que el cavefish es un sistema biológico fascinante para desdoblamiento los mecanismos de la evolución del rasgo, su plena capacidad como un modelo evolutivo no se ha reunido completamente. Esto ha sido parcialmente debido a una incapacidad para manipular la genética y celular función directamente31. Se han identificado genes candidatos que regulan características complejas mediante estudios de rasgos cuantitativos loci (QTL), pero la validación de estos genes candidatos ha sido difícil32,33,34. Recientemente, caída transitoria usando morfolinos, gene edición utilizando sistemas CRISPR y TALEN y el uso de Tol2-transgénesis mediadas se han utilizado para investigar la base genética subyacente a una serie de rasgos35,36,37 ,38. La implementación y normalización de estas técnicas permitirá manipulaciones que interrogan las bases moleculares y neurales de rasgos biológicos, incluyendo la manipulación de la función del gene, el etiquetado de la población definida de la célula, y la expresión de los periodistas funcionales. Considerando que la implementación exitosa de estas herramientas genéticas para manipular el gen o la función celular se ha demostrado en el modelo emergente de los sistemas, protocolos detallados aún carecen de a. mexicanus.
A. mexicanus proporcionan la penetración crítica en los mecanismos de la evolución en respuesta a un entorno cambiante y presentar la oportunidad de identificar nuevos genes que regulan diversos rasgos. Varios factores sugieren que a. mexicanus es un modelo muy manejable para la aplicación de herramientas genómicas establecidas actualmente disponible en los modelos genéticos establecidos, incluyendo la habilidad de fácilmente mantener peces en los laboratorios, cría de gran tamaño, transparencia, un genoma secuenciado y ensayos de comportamiento definido39. Aquí, describimos una metodología para el uso de gen edición en superficie y la cueva de las poblaciones de a. mexicanus, morfolinos y transgénesis. La aplicación más amplia de estas herramientas en a. mexicanus permitirá una investigación mecanicista de los procesos moleculares subyacentes a la evolución del desarrollo, fisiológicas y conductuales diferencias entre peces de superficie y cavefish.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, nos proporciona una metodología para manipular funciones de los genes usando morfolinos, gene CRISPR/Cas9 edición y metodología de la transgénesis. La riqueza de la tecnología genética y la optimización de estos sistemas en el pez cebra es probable que permitirá la transferencia de estas herramientas en a. mexicanus con facilidad52. Hallazgos recientes han utilizado estos métodos en a. mexicanus, pero siguen siendo subutilizados en la investigación de diversos ra…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen Sunishka Thakur de su asistencia en la genotipificación y el pez mutante de oca2 , representado en la figura 2la proyección de imagen. Este trabajo fue financiado por National Science Foundation (NSF) 1656574 a A.C.K., Premio NSF 1754321 J.K. y A.C.K. e institutos nacionales de salud (NIH) Premio R21NS105071 a A.C.K. y E.R.D.
Materials
| Fish breeding & egg supplies | |||
| Fine mesh fish net | Penn Plax | BN4 | |
| Fish tank heater | Aqueon | 100106108 | |
| Egg traps | Custom made | NA | Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette bulbs | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Egg molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Morpholino supplies | |||
| Control Morpholino | Gene Tools, LLC | Standard control olio | |
| Custom Morpholino | Gene Tools, LLC | NA | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290-100ML | |
| CRISPR supplies | |||
| Cas9 Plasmid | AddGene | 46757 | |
| GoTaq DNA Polymerase | Promega | M3001 | |
| KOD Hot Start Taq | EMD Millipore | 71-842-3 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom | |
| T7 Megascript Kit | Ambion/Thermofisher | AM1333 | |
| miRNeasy Kit | Qiagen | 217004 | |
| mMessage mMachine T3 kit | Ambion/Thermofisher | AM1348 | |
| MinElute Kit | Qiagen | 28204 | |
| Tol2 transgenesis supplies | |||
| pCS-zT2TP plasmid | Kawakami et al., 2004 | Request from senior author | |
| CutSmart Buffer | New England Biolabs | B7204 | |
| NotI-HF Restriction Enzyme | New England Biolabs | R3189 | |
| PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| SP6 mMessenger Kit | Ambion/Thermofisher | AM1340 | |
| Microinjection supplies | |||
| Glass Capillary Tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Picoinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micromanipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micmanipulator Base | World Precision Instruments | Steel Plate Base, 10 lbs |
Referências
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