Подражая и манипулирования поджелудочной железы ацинарной протоковой метаплазии в 3-мерной клеточной культуре
Summary
Изоляция первичного железистый клетки, белок выражение или деятельности модуляции, культура и вниз поток приложения обильно полезны в ex vivo исследования ацинарной протоковой метаплазия (ADM), раннее событие в развитии рака поджелудочной железы.
Abstract
Дифференциация железистый клетки протоковой клетки в течение панкреатита и в начале развития рака поджелудочной железы является ключевым процессом, который требует дальнейшего изучения. Чтобы понять механизмы регулирования ацинарной протоковой метаплазия (ADM), ex vivo 3D культуры и дифференциации клеток первичного ацинарной протоковой клетки предлагает много преимуществ по сравнению с другими системами. С техникой здесь модуляции экспрессии белков является простой и быстрый, требующих только один день, чтобы изолировать, стимулировать или вирусно заражать и начать культивирования первичной железистый клетки для изучения процесса адм. В отличие от использования матрицы базальной мембраны, посев железистый клетки кластеров в коллагена я внеклеточного матрикса, позволяет железистый клетки сохраняют самобытность ацинарной до манипуляции. Это очень важно при тестировании вклад различных компонентов для индукции адм Не только последствия цитокинов или других ectopically управляемых факторов для тестирования через эту технику, но вклад общих мутаций, увеличение белков или нокдаун экспрессии белков для тестирования через вирусные инфекции Основная железистый клетки, используя аденовирусных или лентивирусные векторы. Кроме того клетки могут быть повторно изолированы от коллагена или матрица базальной мембраны в конечной точке и проанализированы для выражения протеина.
Introduction
Железистый протоковой метаплазия (ADM) — это защитный механизм течение панкреатита и ключевой процесс вождения развития рака поджелудочной железы1 требует дальнейшего механистического понимания. В то время как воспаление индуцированной ADM реверсивные2, онкогенных мутаций в крас , которые присутствуют в 90% случаев рак поджелудочной железы3, предотвратить дифференциация обратно в железистый фенотип4,5, 6. Culturing и дифференциации первичных железистый клетки в протоковой клетки в культуре 3D позволяет для изучения молекулярных механизмов, регулирующих процесс ADM, который трудно изучать в естественных условиях. Такие ex vivo исследований позволяют в реальном времени визуализации ADM, его водителя и его регуляторы. Было выявлено несколько драйверов ADM процесса, а также механистического понимания по их течению сигнальных путей, или проверить с помощью здесь описал метод. К ним относятся ADM индукции, TGF-α (альфа фактор роста трансформации)-опосредованной выражение MMP-7 (матрицы металлопротеиназы-7) и активации Notch7, а также RANTES (регулируется по активации, нормальной клетки T выразил и выделяется; также известна как лиганд хемокиновых 5 или CCL5) и TNFα (фактора некроза опухоли альфа)-индуцированной ADM через активацию NF-κB (ядерный фактор κB)8. Дополнительные посредника ADM является онкогенный крас9,10, который вызывает увеличение окислительного стресса, что улучшает процесс ADM путем увеличения выражение EGFR (рецептор к эпидермальному фактору роста) и его лигандов, EGF ( эпидермальный фактор роста) и TGF-α11.
Хотя использование линий клеток рака поджелудочной железы является общим для исследования in vitro, культуры главной ячейки предлагают много преимуществ. Например, основной железистый клетки от не трансгенных мышей или мышей, укрывательство инициирующей мутации, например красG12D, являются наиболее подходящей моделью для изучения раннее событие ADM, потому что клетки имеют несколько и управляемой мутации, которые как известно, чтобы присутствовать в начале развития рака поджелудочной железы. Это в отличие от многих линий клеток рака поджелудочной железы, которые имеют несколько мутаций и разнообразные выражения, основанные на проход номер12. Кроме того исследования на животных были проверены сигнальные пути, определены такими средствами. Одно предостережение использования первичных железистый клетки является, что они не могут transfected как типичные рак клеточных линий.
Метод здесь подробно методы железистый клетки изоляции, 3D культуры, которая имитирует ADM, добавляя стимуляторов или модулирующая белков через лентивирусные или аденовирусных инфекций, а также переизоляция клеток в конечной точке для дальнейшего анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Относительно короткий промежуток времени для изоляции, инфекции и покрытие первичных железистый клетки является преимуществом этого метода. В отличие от культивирования железистый клетки от экспланта нарост требует мало практический времени, но она занимает семь дней для нарост жел?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана R01 Грант (CA200572) из низ в PS. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национального института рака или национальных институтов индикаторное спонсорам было никакой роли в изучать дизайн, сбора и анализа данных, решение публиковать, или подготовка рукописи.
Materials
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 ml tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µl | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1000 µl | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 ml | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 ml | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 ml | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
Referências
- Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61 (3), 449-458 (2012).
- Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).
- Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).
- Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Pesquisa do Câncer. 63 (9), 2016-2019 (2003).
- Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).
- Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).
- De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).
- Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).
- Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).
- Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).
- Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).
