Caracterizando a histona modificação pós-traducional alterações nos modelos de Neurodegenerative Proteinopathy de levedura
Summary
Este protocolo descreve procedimentos experimentais para caracterizar todo o genoma de alterações nos níveis de modificações borne-translational do histone (PTM) ocorrendo em relação a superexpressão de proteínas associadas com a ALS e a doença de Parkinson em Modelos de Saccharomyces cerevisiae . Após a separação de SDS-PAGE, níveis PTM histona individuais são detectados anticorpos específicos de modificação através da mancha ocidental.
Abstract
Doenças neurodegenerativas, como esclerose lateral amiotrófica (ela) e a doença de Parkinson (PD), causam a perda de centenas de milhares de vidas anualmente. Opções de tratamento eficazes, capazes de impedir a progressão da doença são escassos. Apesar dos esforços de sequenciamento extensa em grandes populações de pacientes, a maioria dos casos de ALS e PD permanecem inexplicável por mutações genéticas sozinhos. Epigenetics mecanismos, tais como a modificação pós-traducional de proteínas histonas, podem estar envolvidos na progressão e etiologia de doenças neurodegenerativas e levam a novos alvos para intervenção farmacêutica. Mamíferos modelos in vivo e in vitro da ALS e PD são caros e muitas vezes exigem prolongados e laboriosos de protocolos experimentais. Aqui, podemos delinear uma abordagem prática, rápida e econômica para determinar todo o genoma de alterações nos níveis de modificação de histona utilizando Saccharomyces cerevisiae como um sistema modelo. Este protocolo permite investigações abrangentes sobre alterações epigenéticas, ligadas ao proteinopathies neurodegenerativas que corroborar conclusões anteriores em sistemas diferentes do modelo ao mesmo tempo expandindo significativamente nosso conhecimento sobre o Epigenoma de doenças neurodegenerativas.
Introduction
Doenças neurodegenerativas são doenças devastadoras, com pouca ou nenhuma opção de tratamento disponível. Entre estes, a esclerose lateral amiotrófica (ela) e a doença de Parkinson (PD) são particularmente terrível. Aproximadamente 90% dos casos de ALS e PD são considerados esporádicos, ocorrendo sem histórico familiar da doença, enquanto os restantes casos funcionar nas famílias e geralmente estão ligados a um gene específico mutação1,2. Curiosamente, ambos destas doenças estão associados com a proteína mislocalization e agregação de3,4,5,6. Por exemplo, fundido em sarcoma de (FUS) e proteína de ligação a DNA TAR 43 (TDP-43) são proteínas de ligação de RNA que mislocalize para o citoplasma e agregam em ALS7,8,9,10, 11,12, enquanto α-synuclein é o componente do princípio de agregados proteicos denominados corpos de Lewy em PD5,13,14,15.
Apesar dos esforços de associação ampla de genoma-largo em grandes populações de pacientes, a esmagadora maioria dos casos de ALS e PD permanecem inexplicável geneticamente. Pode epigenética desempenham um papel na doença neurodegenerativa? Epigenetics compreende alterações na expressão gênica que ocorrem sem alterações de sequência de DNA subjacente16. Um mecanismo epigenético principal envolve as modificações borne-translational (PTMs) de histona proteínas16. Em células eucarióticas, material genético é fortemente envolvido na cromatina. A unidade básica da cromatina é a nucleossoma, composto por 146 pares de bases de DNA enrolado ao redor de um octamer de histona, composto por quatro pares de histonas (duas cópias de cada das histonas H2A, H2B, H3 e H4)17. Cada histona tem a cauda do N-terminal que se projeta fora do nucleossoma e pode ser modificada pela adição de várias partes de químicas, normalmente em resíduos de lisina e arginina18. Estes PTMs são dinâmicas, o que significa que eles podem ser facilmente adicionados e removidos e incluem grupos como fosforilação, metilação e acetilação. PTMs controlar a acessibilidade do DNA para a maquinaria transcricional e contribuindo assim para controle de expressão de gene18. Por exemplo, a acetilação da histona reduz a força da interação eletrostática entre a proteína histona altamente básica e o backbone de DNA carregado negativamente, permitindo que os genes embalados por histones acetificados para ser mais acessível e, portanto, altamente expresso19. Mais recentemente, a notável especificidade biológica de histona particular PTMs e suas combinações levou o histona código hipótese20,21 na quais proteínas que escrever, apagar e ler PTMs de histona todos agem em conjunto para Module a expressão gênica.
O fermento é um modelo muito útil para estudar a neurodegeneração. Importante, muitos caminhos celulares neuronais são conservados de levedura para seres humanos22,23,24. Levedura recapitular fenótipos de citotoxicidade e inclusões de proteína com superexpressão de FUS, TDP-43 ou α-synuclein22,23,24,25,26. Na verdade, modelos de Saccharomyces cerevisiae de ALS já foram usados para identificar fatores de risco genéticos em seres humanos27. Além disso, o fermento superexpressão α-synuclein humana permitida a caracterização da rede Rsp5 como um destino druggable para amenizar a toxicidade de α-synuclein em neurônios28,29.
Aqui, descrevemos um protocolo explorando Saccharomyces cerevisiae para detectar alterações no genoma-largo do histone PTM associadas com proteinopathies neurodegenerativas (Figura 1). O uso de S. cerevisiae é altamente atraente por causa de sua facilidade de uso, baixo custo e a velocidade em comparação com outros modelos in vitro e animais de neurodegeneração. Aproveitamento anteriormente desenvolvido ALS e PD modelos22,23,25,26, podemos ter overexpressed humana FUS, TDP-43 e α-synuclein em levedura e mudanças PTM descobertos histona distintas ocorrem em conexão com cada proteinopathy30. O protocolo que descrevemos aqui pode ser concluído em menos de duas semanas de transformação para análise de dados.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui fornece uma maneira simples, conveniente e econômica de categorização de alterações de todo o genoma do histone PTM correlacionadas com proteinopathies neurodegenerativas. Embora existam outros modelos de ALS e PD, como in vitro murino e linhas de células humanas modelos de32, S. cerevisiae permanece atraente por causa de sua facilidade de uso. Por exemplo, modelos de fermento não requer o uso de um capuz estéril, nem eles exigem o intensivo trei…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Royena Tanaz, Huda Yousuf e Sadiqa Taasen para ajuda técnica. Nós estamos muito gratos ao Prof James Shorter para a oferta generosa de reagentes e assistência intelectual no design de experimentos de sintonização de sacarose. Plasmídeos de levedura foram um presente generoso do Prof Aaron Gitler (incluindo 303Gal-FUS; Plasmídeo Addgene # 29614). Brooklyn College e o centro de pesquisa ciência avançada (CUNY), bem como um NIH NINDS Advanced Postdoctoral transição Award (K22NS09131401) com suporte M.P.T.
Materials
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
Referências
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