هذا البروتوكول يحدد الإجراءات التجريبية لوصف التغييرات على نطاق الجينوم في مستويات هيستون تعديلات بوستترانسلاشونال (PTM) التي تحدث بصدد overexpression البروتينات المرتبطة بالمرض ومرض باركنسون في نماذج saccharomyces cerevisiae . بعد الانفصال الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، وقد تم اكتشاف مستويات PTM هيستون الفردية مع الأجسام المضادة الخاصة بالتعديل عن طريق النشاف الغربية.
أمراض الأعصاب مثل التصلب العضلي الجانبي (المرض) ومرض باركنسون (PD)، يؤدي ذلك إلى فقدان مئات الآلاف من الأرواح كل عام. لا توجد خيارات العلاج فعالة قادرة على وقف تطور المرض. على الرغم من جهود تسلسل واسعة في إعداد كبيرة من السكان المريض، تظل معظم حالات المرض والمشتريات غير المبررة بالطفرات الوراثية وحدها. قد تكون ضالعة في مسببات أمراض الأعصاب وتطور آليات التخلق، مثل تعديل بوستترانسلاشونال من البروتينات هستون، وتؤدي إلى أهدافا جديدة للتدخل الصيدلانية. نماذج في المختبر والمجراه في الثدييات من المرض و PD مكلفة وغالباً ما تتطلب البروتوكولات التجريبية طويلة وشاقة. هنا، فإننا مخطط اتباع نهج عملي وسريع وفعال من حيث التكلفة لتحديد التعديلات على نطاق الجينوم هستون تعديل مستويات استخدام Saccharomyces cerevisiae كنظام نموذجي. يسمح هذا البروتوكول لإجراء تحقيقات شاملة في تغييرات جينية متصلاً بروتينوباثيس الأعصاب التي تؤكد النتائج السابقة في نظم نموذجية مختلفة أثناء توسيع معرفتنا بدرجة كبيرة ابيجينومي أمراض الأعصاب.
أمراض الأعصاب أمراض مدمرة مع قليل من لا خيارات العلاج المتاحة. ومن بين هذه، التصلب العضلي الجانبي (المرض) ومرض باركنسون (PD) مروعة خاصة. وتعتبر حوالي 90% حالات المرض و PD المتفرقة، التي تحدث دون تاريخ عائلي للمرض، في حين أن الحالات المتبقية تشغيل في الأسر وترتبط عموما بتحور جينات محددة1،2. من المثير للاهتمام، كل هذه الأمراض المرتبطة بالبروتين ميسلوكاليزيشن وتجميع3،4،،من56. على سبيل المثال، تنصهر في ساركومه (فوس) و “القطران الحمض النووي” ملزم بروتين 43 (ماساتشوستس-43) هي بروتينات ملزمة الجيش الملكي النيبالي أن ميسلوكاليزي إلى السيتوبلازم وتجميعها في المرض7،،من89،10، 11،12، بينما α-سينوكلين هو المبدأ المكون من المجاميع البروتينية ووصف الهيئات ليوى في PD5،13،،من1415.
على الرغم من جهود مكثفة على نطاق الجينوم الرابطة في إعداد كبيرة من السكان المريض، تظل الغالبية العظمى من حالات المرض والمشتريات غير المبررة وراثيا. يمكن التخلق تلعب دوراً في أمراض الأعصاب؟ التخلق يشمل تغييرات في الجينات التي تحدث دون تغيير تسلسل الحمض النووي الأساسية16. إليه جينية رئيسية تنطوي على التعديلات متعدية وظيفة (بتمس) من البروتينات هستون16. في الخلايا حقيقية النواة، يتم تغليف المواد الجينية محكم في الكروماتين. وحدة قاعدة من الكروماتين نوكليوسومي، يتألف من 146 أزواج قاعدة الحمض النووي الملتفة حول أوكتامير هستون، يتألف من أربعة أزواج من histones (نسختين كل من histones H2A، H2B و H3 و H4)17. وقد كل هستون ذيل الطرفي ن أن يبرز من أصل نوكليوسومي ويمكن تعديله بإضافة مويتيس الكيميائية المختلفة، عادة على بقايا يسين وارجينين18. هذه بتمس بالدينامية، مما يعني أنها يمكن بسهولة إضافة وإزالة، وتشمل مجموعات مثل acetylation ومثلايشن الفسفرة. بتمس التحكم في إمكانية الحصول على الحمض النووي لآلية النسخي، ومن ثم تساعد مراقبة الجينات التعبير18. على سبيل المثال، acetylation هيستون يقلل من قوة التفاعل الكهربائي بين هيستون الأساسية عالية البروتين والحمض النووي مشحونة سلبا على العمود الفقري، السماح للجينات وجبات من هيستونيس أسيتيلاتيد لتكون في متناول أكثر وبالتالي درجة عالية وأعرب19. في الآونة الأخيرة، أدى خصوصية بيولوجية ملحوظة بتمس هيستون خاصة وتشكيلاتها إلى هستون رمز الفرضية20،21 في البروتينات التي أن كتابة ومسح وقراءة هيستون بتمس جميعا أن نعمل يدا واحدة تعدل التعبير الجيني.
الخميرة نموذج مفيد جداً لدراسة نيوروديجينيريشن. الأهم من ذلك، يتم المحافظة عليها العديد من مسارات الخلايا العصبية من الخميرة للبشر22،،من2324. تلخيص الخميرة تعمل سيتوتوكسيسيتي وتضمينات البروتين عند overexpression فوس، ماساتشوستس-43، أو α-سينوكلين22،،من2324،،من2526. وفي الواقع، قد استخدمت نماذج Saccharomyces cerevisiae المرض لتحديد عوامل الخطر الجينية في البشر27. وعلاوة على ذلك، الخميرة overexpressing البشري α-سينوكلين يسمح لتوصيف الشبكة Rsp5 كهدف دروجابل للتخفيف من سمية α-سينوكلين في الخلايا العصبية،من2829.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول استغلال Saccharomyces cerevisiae للكشف عن التغييرات PTM هيستون الجينوم المنظومة المرتبطة بالاعصاب بروتينوباثيس (الشكل 1). استخدام S. cerevisiae جذابة للغاية بسبب سهولة الاستخدام، منخفضة التكلفة، والسرعة مقارنة بنماذج أخرى في المختبر والحيوان من نيوروديجينيريشن. تسخير سابقا وضع المرض و PD نماذج22،23،،من2526، وإننا قد overexpressed البشرية فوس، ماساتشوستس-43 و α-سينوكلين في الخميرة وكشفت هيستون متميزة PTM التغيرات التي تحدث في اتصال مع كل بروتينوباثي30. يمكن إكمال البروتوكول الذي يصف لنا هنا في أقل من أسبوعين من التحول إلى تحليل البيانات.
ينص البروتوكول على وصف هنا بطريقة مباشرة ومناسبة وفعالة من حيث التكلفة لتصنيف التغيرات PTM هيستون على نطاق الجينوم يرتبط مع بروتينوباثيس الأعصاب. بينما هناك نماذج أخرى من المرض، وشعبة المشتريات، مثل في المختبر خطوط الخلايا البشرية والفاري نماذج32, S. cerevisiae تظل جذابة ب…
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر رينا طناز وهدى يوسف تاسين صديقى للحصول على مساعدة تقنية. ونحن ممتنون جداً للبروفيسور جيمس أقصر لتوفير الكواشف والفكرية المساعدة في تصميم تجارب ضبط السكروز سخية. والبلازميدات الخميرة كانت هدية سخية من البروفيسور آرون جيتلير (بما في ذلك غال 303-فوس؛ بلازميد # 29614 من أدجيني). كلية بروكلين ومتقدمة علوم بحوث مركز (CUNY)، فضلا عن المعاهد الوطنية للصحة NINDS المتقدمة بعد الدكتوراه مرحلة انتقالية جائزة (K22NS09131401) تدعم M.P.T.
-His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |