विशेषता हिस्one पोस्ट-translational में संशोधन परिवर्तन खमीर न्यूरोडेजेनेरेटिव प्रोटिनोपैथी मॉडल
Summary
इस प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की रूपरेखा को हिस्टोन के स्तर में जीनोम व्यापक परिवर्तन विशेषता के बाद translational संशोधनों (ptm) में ALS और पार्किंसंस रोग के साथ जुड़े प्रोटीन के overexpression के संबंध में होने वाली सैचरोमाइसीज़ सेरेविस्सी मॉडल | एसडीएस-पृष्ठ जुदाई के बाद, व्यक्तिगत हिस्टोन ptm स्तर पश्चिमी blotting के माध्यम से संशोधन विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ पता चला रहे हैं ।
Abstract
तंत्रिका अपक्षयी रोग, जैसे कि आमयोपोषी पार्श्व स्क्लेरोसिस (ए. ए. पी.) और पार्किंसंस रोग (पीडी), हर साल हजारों की सैकड़ों लोगों की हानि का कारण है । रोग प्रगति को रोकने में सक्षम प्रभावी उपचार विकल्प की कमी है । बड़े रोगी आबादी में व्यापक अनुक्रमण प्रयासों के बावजूद, एलों और पीडी मामलों के बहुमत आनुवंशिक उत्परिवर्तनों से अकेले अस्पष्टीकृत रह । उपआनुवंशिकी तंत्र, इस तरह के बाद के रूप में-हिस्टोन प्रोटीन के translational संशोधन, न्यूरोडेजेनेरेटिव रोग एटियलजि और प्रगति में शामिल किया जा सकता है और दवा हस्तक्षेप के लिए नए लक्ष्य के लिए नेतृत्व. वीवो में स्तनधारी और ALS और पीडी के विट्रो मॉडल में महंगा है और अक्सर लंबे समय तक और श्रमसाध्य प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है । यहाँ, हम एक मॉडल प्रणाली के रूप में saccharomyces cerevisiae का उपयोग कर हिस्टोन संशोधन के स्तर में जीनोम व्यापक परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए एक व्यावहारिक, तेजी से, और लागत प्रभावी दृष्टिकोण की रूपरेखा । इस प्रोटोकॉल पश् चजात न्यूरोडेजेनेरेटिव proteinopathies से जुड़े परिवर्तन में व्यापक जांच के लिए अनुमति देता है कि विभिंन मॉडल प्रणालियों में पिछले निष्कर्षों की पुष्टि करते हुए काफी के हमारे ज्ञान का विस्तार तंत्रिका अपक्षयी रोग एपिजीनोम ।
Introduction
न्यूरोडेजेनेरेटिव रोगों कोई इलाज उपलब्ध विकल्प के लिए थोड़ा के साथ विनाशकारी बीमारियों हैं । इन के अलावा, पेशीशोषी पार्श्व स्क्लेरोसिस (ALS) और पार्किंसंस रोग (पीडी) विशेष रूप से भयानक हैं । लगभग ९०% ALS और पीडी मामलों छिटपुट, रोग के परिवार के इतिहास के बिना होने वाली माना जाता है, जबकि शेष मामलों परिवारों में चलाने के लिए और आम तौर पर एक विशिष्ट जीन उत्परिवर्तन1,2से जुड़े हुए हैं । दिलचस्प है, इन दोनों बीमारियों के प्रोटीन mislocalization और एकत्रीकरण3,4,5,6के साथ जुड़े रहे हैं । उदाहरण के लिए, सार्कोमा (संगलित) और राल डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन ४३ (टीडीपी-४३) में संगलित है rna बाध्यकारी प्रोटीन है कि कोशिका द्रव्य को mislocalize और ALS में कुल7,8,9,10, 11,12, जबकि α-उपकेन्द्रक, प्रोटेनिशियस समुच्चय का मुख्य घटक है, जिसे पीडी5,13,14,15में लेवी शरीरों के रूप में माना जाता है ।
बड़े रोगी आबादी में व्यापक जीनोम व्यापक संघ के प्रयासों के बावजूद, ALS और पीडी मामलों के भारी बहुमत अनसमझाया आनुवंशिक रूप से रहते हैं । क्या एपिजेनेटिक्स न्यूरोडेजेनेरेटिव डिजीज में भूमिका निभा सकता है? एपिजेनेटिक्स अंतर्निहित डीएनए अनुक्रम16में परिवर्तन के बिना होने वाली जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन शामिल हैं । एक मुख्य एपिजेनेटिक तंत्र में हिस्टोन प्रोटीन16के बाद शोधों संशोधनों (ptms) शामिल है । यूकार्योटिक कोशिकाओं में आनुवंशिक पदार्थ को क्रोमेटिन में कसकर लपेटा जाता है । क्रोमेटिन की आधार इकाई नाभिक है, जिसमें १४६ आधार जोड़े डीएनए के एक हिस्टोन ऑक्टामर के चारों ओर लिपटे होते हैं, जो चार जोड़ों के हिस्टोनों से बना होता है (दो प्रतियां H2A, H2B, H3 और H4)17। प्रत्येक हिस्टोन में एक एन-टर्मिनल पूंछ होती है जो नाभिकोणों से बाहर निकलती है और इसे विभिन्न रासायनिक मॉइटीज के परिवर्धन द्वारा संशोधित किया जा सकता है, आमतौर पर लिसाइन और आर्जिनिन अवशेषों पर18। इन PTMs गतिशील हैं, जिसका अर्थ है कि वे आसानी से जोड़ा और हटाया जा सकता है, और इस तरह के acetylation के रूप में समूहों, methylation, और फॉस्फोरिलेशन शामिल हैं । PTMs नियंत्रण transअपंग मशीनरी के लिए डीएनए की पहुंच, और इस तरह नियंत्रण जीन अभिव्यक्ति18मदद करते हैं । उदाहरण के लिए, हिस्टोन ऐसीटिलन उच्च बुनियादी हिस्टोन प्रोटीन और नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए रीढ़ के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत की ताकत कम कर देता है, ऐसीटिलन हिस्टोन द्वारा पैक जीन की अनुमति अधिक सुलभ हो सकता है और इस प्रकार अत्यधिक व्यक्त१९. हाल ही में, विशिष्ट हिस्टोन ptms के उल्लेखनीय जैविक विशिष्टता और उनके संयोजनों हिस्टोन कोड परिकल्पना20,21 में जो प्रोटीन है कि लिखने, मिटा, और पढ़ें हिस्टोन ptms सभी संगीत कार्यक्रम में अधिनियम के लिए नेतृत्व किया है जीन अभिव्यक्ति मिलाना ।
खमीर एक बहुत ही उपयोगी के लिए neurodegeneration: पतन का अध्ययन मॉडल है । महत्वपूर्ण बात, कई न्यूरोनल सेलुलर रास्ते खमीर से मनुष्यों के लिए22,23,24संरक्षित कर रहे हैं । खमीर fus, टीडीपी-४३, या α-synuclein22,23,24,25,26के overexpression पर कोशिका आविषता phenotypes और प्रोटीन inclusions पुनर्पूंजीकरण । वास्तव में, सैचरोमाइसीज़ सेरेवीसी मॉडलों को मनुष्यों में आनुवंशिक जोखिम कारकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है27. इसके अलावा, खमीर मानव α-syनाभिक overexpressing के लिए एक druggable लक्ष्य के रूप में Rsp5 नेटवर्क के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति दी ंयूरॉंस में α-synuclein विषाक्तता सुधार करने के लिए28,29।
यहां, हम न्यूरोडेजेनेरेटिव प्रोथिनोपैथी (चित्रा 1) के साथ जुड़े जीनोम चौड़ा हिस्टोन ptm परिवर्तन का पता लगाने के लिए saccharomyces cerevisiae शोषण प्रोटोकॉल का वर्णन । एस cerevisiae का उपयोग अत्यधिक आकर्षक है क्योंकि उपयोग की अपनी आसानी, कम लागत, और गति की तुलना में अंय विट्रो और तंत्रिका अध: पतन के पशु मॉडल में । पहले विकसित किए गए ALS और पीडी मॉडलों का दोहन22,23,25,26, हम मानव fus, टीडीपी-४३ और α-synuclein खमीर में और उजागर विशिष्ट हिस्टोन ptm परिवर्तन में होने वाले overexpressed किया है प्रत्येक प्रोटिनोपैथी के साथ संबंध30. प्रोटोकॉल है कि हम यहां का वर्णन रूपांतरण से डेटा विश्लेषण के लिए दो सप्ताह से भी कम समय में पूरा किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक सरल, समीचीन, और लागत प्रभावी तरीके से categorizing जीनोम चौड़ा हिस्टोन ptm परिवर्तन neurodegenerative प्रोतीनोपैथी के साथ सहसंबद्ध प्रदान करता है । जबकि वहां ALS और पीडी के अंय मॉडल, इस तरह के रूप मे?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
तकनीकी मदद के लिए हम रोयेन तनाज, हुदा यूसूफ, और सादिक्यु तासें का शुक्रिया अदा करते हैं । हम सुक्रोज ट्यूनिंग प्रयोगों के डिजाइन में अभिकर्मकों और बौद्धिक सहायता के उदार प्रावधान के लिए प्रो जेम्स कम के लिए बहुत आभारी हैं । खमीर plasmids प्रो हारून Gitler से एक उदार उपहार थे (303Gal-FUS सहित; ऐडजीन प्लाज्मिड # २९६१४). ब्रुकलिन कॉलेज और उंनत विज्ञान अनुसंधान केंद्र (CUNY) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक NIH NINDS उंनत Postdoctoral संक्रमण पुरस्कार (K22NS09131401) का समर्थन किया M.P.T.
Materials
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
Referências
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