Cultivo de microalgas verdes em fotobiorreatores coluna de bolha e um ensaio para lípidos neutros

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para construir laboratório-escala bolha coluna fotobiorreatores e usá-los para a cultura de microalgas. Ele também fornece um método para a determinação da taxa de crescimento da cultura e do conteúdo de lipídios neutros.

Abstract

Há grande interesse no estudo das microalgas para aplicações de engenharia, tais como a produção de biocombustíveis, produtos de alto valor e para o tratamento de resíduos. Como a maioria dos novos esforços de pesquisa começam em escala de laboratório, há uma necessidade de métodos de baixo custo para cultivo de microalgas de forma reproduzível. Aqui, nós nos comunicamos uma abordagem eficaz para cultura de microalgas em fotobiorreatores escala de laboratório e para medir o crescimento e o conteúdo de lipídios neutros de que algas. Também estão incluídas para instruções sobre como configurar o sistema de photobioreactor. Embora os organismos de exemplo são espécie de Chlorella e Auxenochlorella, este sistema pode ser adaptado para cultivar uma grande variedade de microalgas, incluindo co culturas de algas com espécies não-algas. Culturas-mãe primeiro são cultivadas em garrafas para produzir inóculo para o sistema de photobioreactor. Inóculo de algas é concentrado e transferido para fotobiorreatores para cultivo em modo de lote. As amostras são coletadas diariamente para as leituras da densidade óptica. No final da cultura lote, as células são colhidas por centrifugação, lavada e congelam secas para obter uma concentração final de peso seco. A concentração final de peso seco é usada para criar uma correlação entre a densidade óptica e a concentração de peso seco. Um método de Folch modificado subsequentemente é usado para extrair lipídios totais a partir da biomassa liofilizada e o extrato é analisado por seu conteúdo de lipídio neutro usando um ensaio de microplacas. Este ensaio foi publicado anteriormente, mas as etapas do protocolo foram incluídas aqui para destacar os passos críticos no procedimento onde frequentemente ocorrem erros. O sistema de biorreator descrito aqui preenche um nicho entre balão simples cultivo e biorreatores comerciais totalmente controlado. Mesmo com apenas 3-4 biológico repetições por tratamento, nossa abordagem para cultivo de algas leva a desvios-padrão apertados nos ensaios crescimento e lipídios.

Introduction

O aplicativo de microalgas em engenharia e biotecnologia tem atraído grande interesse nos últimos anos. Microalgas estão sendo estudados para uso em águas residuais tratamento^1,2,3,4, biocombustível produção^5,6,7,8e o produção de nutracêuticos e outros produtos de alto valor^9,10. As algas são também sendo geneticamente modificadas em taxas maiores em um esf....

Protocol

1. configuração de bolha coluna fotobiorreatores

1. Construa um conjunto de tampas ventiladas das tampas de plástico que veio com as garrafas de vidro de 1 L e tubos de hibridação (ver Figura 1 para esquemas e fotos). Construa tampas para o umidificador, armadilha, cada ar elevador photobioreactor e cada frasco reator de mistura.
   1. ¼" furos na tampa: 2 furos são necessários para as tampas de biorreator e umidificador; 3 furos são necessários para a armadilha da mistura.
   2. Deslizar um ¼" o-ring sobre os segmentos de um encaixe de Luer de montagem de painel 1/8" e isto Introduza o ¼" buraco perfurado na tampa (

Results

Este procedimento resulta em um curso de tempo dos dados de densidade óptica das algas em OD 550 nm (Figura 4A). A densidade óptica e peso seco concentração de dados podem ser correlacionados (Figura 4B). Isso é feito calculando a concentração de algas de peso seco final após a etapa de liofilização. Em seguida, a densidade óptica da diluição serial cultura (realizada no último dia de amostragem) e as concentrações do peso seco r.......

Discussion

A consideração mais importante quando o cultivo de algas é uma compreensão das necessidades específicas do organismo ou grupo de organismos. As algas, sistema de cultivo descrito aqui pode ser usado para a cultura de uma grande variedade de algas, mas os específicos fatores abióticos (temperatura, mídia, pH, intensidade de luz, nível de CO₂ , a taxa de aeração) precisam ser ajustado às necessidades do organismo. Observe os parâmetros descritos aqui foram usados para o cultivo de Chlorella e Auxeno.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Suprimentos para configuração de fotobiorreator airlift
1 L Garrafas Pyrex	Corning	16157-191	Para reatores de garrafas, umidificadores
1/2" braçadeira de mangueira	Home Depot	UC953A	ou equivalente
1/4" fêmea luer para farpa	Nordson biomedical	Nordson FTLL360-6005	1/4" ID, PP
Tubulação de PVC autoclavável de 1/4" ID, 3/8" OD	Thermo-Nalgene	63013-244	50'1
/4" em O-rings	Grainger	1REC5	#010 Anel de Vedação de Silicone Duro Médio, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
Luer fêmea de 1/8" para farpa	Nordson biomedical	FTLL230-6005
1/8" ID, tubulação de PVC autoclavável de 1/4" OD	Thermo-Nalgene	63013-608	250'1
/8" luer giratório macho para farpa	Nordson biomedical	MLRL013-6005
1/8" farpa multiportas	Nordson biomedical	4PLL230-6005	1/8" farpa
1/8" NPT para barb	Nordson biomedical	18230-6005	1/8" 200 series barb
1/8" montagem em painel luer	Nordson biomedical	Nordson MLRLB230-6005	1/8", PP
10 galão tanque de peixes	Walmart	802262	Pode conter até 8 biorreatores dependendo do layout
Medidor de fluxo de 100-1000 ccm	Dwyer	RMA-13-SSV	Para reatores de garrafa
2 pés banco de luz fluorescente	Agrobrite	FLT24 T5
medidor de vazão de 200-2500 ccm	Dwyer	RMA-14-SSV	Para regulação do ar a montante do umidificador
garrafas de pirex de 250 mL	Corning	16157-136	Para mistura de gás após umidificador
medidor de vazão de 50-500 ccm	Dwyer	RMA-12-SSV	Para reatores de tubo de hibridização
medidor de vazão de 5-50 ccm	Dwyer	RMA-151-SSV	Para controle de vazão de CO2
Filtros de ar 0,2 µ m	Whatman/ Fisher	09-745-1A	Polyvent, 28 mm, 0.2 µ m, PTFE, pacote de 50
Válvulas de retenção	VWR	89094-714
Tampas Corning para garrafas de pirex	VWR	89000-233	10 tampas GL45
Tampa luer fêmea	Nordson biomedical	Nordson FTLLP-6005	PP estáveis fêmea
	Corning	32645-030	35x300 mm, pacote de 2
temporizadores de luz	Walmart	556393626
Contraporcas	Nordson biomedical	Nordson LNS-3	1/4", nylon vermelho
Agitador magnético de baixo perfil	VWR	10153-690	Agitador magnético de baixo perfil
Tampa de extremidade luer macho	Nordson biomedical Nordson	LP4-6005	Plugue macho PP
Anel de bloqueio luer giratório	Nordson biomedical	Nordson FSLLR-6005
Barras de agitação - VWR longo		58949-040	38,1 mm, para reatores de garrafas
Barras de agitação - médio	VWR	58949-034	25 mm, para tubos de hiridização
Suprimentos e reagentes para cultura de algas
0,2 µ m filtros	VWR	28145-491	13 mm, PTFE, para filtrar meios usados de amostras de culturas diárias
Seringas de 1 mL	Air-tite	89215-216	Para filtrar meios usados de amostras de culturas diárias
Tubos de 1,5 ml	VWR	87003-294	Pipetas serológicas estéreis (ou equivalente)
10 mL Greiner	Bio-One	82050-482	Estéril (ou equivalente)
100 mm placas	VWR	25384-342	Placas de Petri empilháveis de 100x15 mm, tubos estéreis
15 mL	Greiner Bio-One	82050-276	Estéril (ou equivalente), polipropileno
2 mL Ponteiras de pipeta serológicas	Greiner Bio-One	82051-584	Estéril (ou equivalente)
Tubos de 2 mL	VWR	87003-298	Estéril (ou equivalente)
Tubos de 50 mL	Greiner Bio-One	82050-348	Microplaca de polipropileno estéril (ou equivalente)
de 96 poços	Greiner Bio-One	89089-578	Poliestireno com tampa, fundo plano
Alças inocculantes	VWR	80094-478	Estéril (ou equivalente)
Tanque e regulador de dióxido de carbono líquido	Airgas	CD-50
Suprimentos e reagentes para extração de lipídios e ensaio de lipídios neutros
2 mL	VWR	10158-556	Tubo de polipropileno com tampa
Microplacas de 96 poços	Greiner Bio-One	82050-774	Polipropileno, fundo plano
Alvejante	Walmart	550646751	Use apenas alvejante regular, não alvejante de limpeza
Clorofórmio	BDH	BDH1109-4LG
Dimetilsulfóxido	BDH	BDH1115-1LP
Álcool isopropílico	BDH	BDH1133-1LP
Metanol	BDH	BDH20864.400
Vermelho do Nilo	VWR	TCN0659-5G
Ponteiras de pipeta Pasteur	VWR	14673-010
Cloreto de sódio	BDH	BDH9286-500G
Óleo vegetal	Walmart	9276383	Qualquer óleo vegetal deve funcionar desde que seja fresco
Zircônia / esferas de sílica (0,5 mm de diâmetro)	Produtos Biospec	11079105z
Equipamento
Balança analítica	Mettler-Toledo	XS205DU	Capaz de pelo menos 4 decimais de precisão
Homogeneizador de contas	Omni	19-040E
Microcentrífuga de bancada	Thermo	Heraeus Fresco 21 com 24x2	Incluindo rotor capaz de manusear tubos de 1,5 e 2 mL
Aquecedor de bloco seco	VWR	75838-282	Incluindo bloco seco para um secador de microplacas
Liofilizador	Labconco	7670520	2,5L Sistema de liofilização
grande Thermo		Heraeus Megafuge 16R Tissue	Incluindo rotores capazes de lidar com garrafas de 400 mL, tubos de 50 mL e tubos de 15 mL Leitor
microplacas	Dispositivos moleculares	SpectraMax M2	Capaz de ler absorbância e fluorescência
Misturador de vórtice	VWR	10153-838