Induksjon og scoring av pode-versus-host sykdom i en Xenogeneic murine modell og kvantifisering av menneskelige T celler i mus vev ved hjelp av digital PCR

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å indusere og score sykdom i en xenogeneic pode-versus-host sykdom (xenoGVHD) modell. xenoGVHD gir en in vivo-modell for å studere immunsuppresjon av menneskelige T-celler. I tillegg beskriver vi hvordan du kan oppdage menneskelige T-celler i vev med digital PCR som et verktøy for å kvantifisere immunsuppresjon.

Abstract

Akutt pode-versus-host sykdom (GVHD) er en betydelig begrensning for pasienter som får blodkreft stilk cellen transplantasjon som terapi for hematologiske mangler og ondartet. Akutt GVHD oppstår når donor T celler anerkjenner vert vev som et utenlandsk antigen og montere en immunrespons til verten. Nåværende behandlinger involverer giftige immunsuppressiv medikamenter som gjør pasienter utsatt for infeksjon og gjentakelse. Dermed er det pågående forskning for å gi en akutt GVHD terapi som effektivt kan målrette donor T celler og redusere bivirkninger. Mye av dette pre-klinisk arbeid bruker xenogenic GVHD (xenoGVHD) murine modell som gjør det mulig for testing av immunsuppressiv behandling på menneskelige celler i stedet for murine celler i en in vivo system. Denne protokollen skisserer hvordan å indusere xenoGVHD og hvordan å blinde og standardisere klinisk scoring for å sikre konsistente resultater. I tillegg beskriver denne protokollen hvordan du bruker digital PCR til å oppdage menneskelige T-celler i mus vev, som senere kan brukes til å kvantifisere effekten av testede terapier. Den xenoGVHD modellen gir ikke bare en modell for å teste GVHD terapier, men noen terapi som kan undertrykke menneskelige T-celler, som deretter kan brukes på mange inflammatoriske sykdommer.

Introduction

Allogene blodkreft stilk cellen transplantasjon (HSCT) har blitt rutinemessig behandling for pasienter som lider av hematologiske ondartet som leukemi med dårlig prognose. En betydelig komplikasjon av HSCT er akutt pode-versus-host sykdom (GVHD). En 2012 studie rapporterte at akutt GVHD utviklet i 39% av HSCT pasienter som fikk transplantasjon fra søsken givere og 59% av pasientene som fikk transplantasjon fra urelaterte donorer¹. Akutt GVHD oppstår når donor-avledet T-celler angriper mottakerens organer. Den eneste vellykkede terapi for GVHD er behandling med svært immunsuppressiv narkotika², som er svært giftig og øke risikoen for infeksjon og tumor tilbakefall. Således, til tross for forbedringer som er gjort i akutt GVHD overlevelse de siste årene^3,4,5, er det fortsatt et kritisk behov for økt GVHD behandling med minimal toksisitet som fremmer langsiktig remisjon.

Det overordnede målet med følgende metoder er å indusere og score xenogeneic GVHD (xenoGVHD). Den xenoGVHD modellen ble utviklet som et verktøy for å indusere akutt GVHD med menneskelige celler i stedet for murine celler som tillater mer direkte oversettelse av pre-klinisk GVHD forskning til kliniske studier⁶. Denne modellen innebærer intravenøs injeksjon av humant perifere blod mononukleære celler (PBMC) i NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) mus som er subletalt bestrålt. Injisert menneskelige T-celler aktiveres av humant antigen presentere celler (APCs) presenterer murine antigen og aktiverte T celler migrere til fjerne vev som resulterer i systemisk betennelse og til slutt død^{6,7, 8} på alle ^{, 9} andre priser ^{, 10}. sykdom patologi og progresjon i xenoGVHD modellen tett etterligne menneskelige akutt GVHD. Spesielt er de patogene menneskelige T-celler reaktive til murine Major histocompatibility Complex (MHC) proteiner, som ligner på T-cellen alloreactivity i Human GVHD^6,9. Den primære fordelen med xenoGVHD modellen over musen MHC-konflikt modell, den andre mye brukt GVHD modell, er det gir mulighet for testing av terapier på menneskelige celler i stedet for murine celler. Dette gjør det mulig for testing av produkter som direkte kan oversettes til klinikken uten noen modifikasjoner fordi de er laget for å målrette menneskelige celler. Nylig har denne modellen blitt brukt til å teste et menneske anti-IL-2 antistoff¹¹, Human Tymusatrofi regulatoriske T-celler (Tregs)¹² og menneskelige Mesenchymal stamceller¹³ som potensielle behandlinger for akutt GVHD. I en større sammenheng kan denne modellen brukes som en in vivo undertrykkelse analysen for ethvert legemiddel eller celle type som kan undertrykke menneskelig T celle aktivitet. For eksempel brukte stockis et al.¹⁴ xenoGVHD modellen til å studere effekten av blokkering integrin ΑVβ8 på treg undertrykkende aktivitet in vivo. Dermed kan xenoGVHD modellen gi innsikt i mekanismen for enhver terapi målretting T-celler i en in vivo innstilling.

En ekstra metode som er beskrevet i denne protokollen er hvordan man skal oppdage menneskelige T-celler i mus vev ved hjelp av digitale polymerase kjedere reaksjon (dPCR). Målet med denne metoden er å tilby et verktøy for å kvantifisere migrasjon og spredning av T-celler i målet vev, som måler effekten av immunsuppressiv terapier testes i denne modellen. dPCR er en relativt ny metode for kvantifisering av nukleinsyre syrer¹⁵. Kort sagt er PCR reaksjonsblandingen delt inn i partisjoner som inneholder små antall mål sekvensen eller ikke noe mål i det hele tatt. Mål sekvensen forsterkes og oppdages ved hjelp av DNA-interkalering fargestoffer eller fluorescerende mål spesifikke sonder. dPCR kvantifiserer antall eksemplarer av mål sekvensen basert på brøkdel av positive partisjoner og Poisson ‘ s statistikk^15,16. Oppdage T-celler med dPCR krever mye mindre vev sammenlignet med andre alternative metoder, inkludert Flow flowcytometri og histologi, og kan utføres på frossen eller fast vev. dPCR krever ikke en standard kurve for å finne kopi numre, og det er heller ikke tekniske replikerer som kreves. Dette reduserer mengden av reagens og mal DNA som trengs for dPCR sammenlignet med tradisjonell kvantitativ PCR (qPCR)¹⁶. Partisjonering av PCR-reaksjonen i sub-reaksjoner i dPCR konsentrerer effektivt mål¹⁷. Således er dPCR primært et verktøy for påvisning av sjeldne mål i en stor mengde ikke-Target DNA. For eksempel, dPCR brukes til å oppdage bakteriell forurensning i melk¹⁸, identifisere sjeldne mutasjoner i østrogen reseptoren genet¹⁹, og oppdage sirkulerende tumor DNA i blodet av pasienter²⁰. I denne protokollen, dPCR fungerer som et effektivt verktøy for å oppdage og kvantifisere menneskelige T-celler i vev av mus med xenoGVHD.

Protocol

Alle musen eksperimenter ble utført i samsvar, og med godkjenning fra, University of Kansas Medical Center institusjonelle Animal Care og use Committee. Alle friske menneskelige blodprøver ble innhentet under informert samtykke og med godkjennelse fra den institusjonelle Review Board ved University of Kansas Medical Center. 1. bestråling av NSG Mouse En dag før injeksjon med PBMC irradiate 8 – 12 uker gamle NSG-mus (begge kjønn kan brukes). I et sterilt biosafety kabinett, pla…

Representative Results

Subletalt bestrålt 8-12-uke gamle NSG mus av begge kjønn som fikk menneskelige PBMC begynte å vise kliniske tegn på GVHD rundt dag 10 etter injeksjon sammenlignet med negative kontroll mus som fikk PBS bare (figur 1a). XenoGVHD-mus hadde en median overlevelse på 23,5 dager (figur 1B). Med digital PCR, CD3 Epsilon positive menneskelige T-celler kan påvises i lungene og leveren prøver av mus som fikk menneskelige PBMC. Vevsp…

Discussion

Sykdomsprogresjon er generelt konsistent i xenoGVHD-modellen, selv med injeksjon av PBMC fra ulike donorer, slik at flere eksperimenter kan kombineres. De viktigste trinnene som kreves for å opprettholde denne konsistensen er riktig IV injeksjon teknikk, blendende og konsistent scoring. En studie av Nervi et al.²⁵ viste at sammenlignet med intravenøs hale vene injeksjon, retro-orbital INJEKSJONER av PBMC resulterte i mer konsistent engraftment og mer alvorlig GVHD. Leon-Rico et al.<sup class="xr…

Materials

1.5 mL eppendorf tubes	Fisher	05-408-129
10 mL serological pipet	VWR International	89130-898
10mL BD Vacutainers – Green capped with Sodium Heparin	Becton Dickinson	366480
250 µL Ranin pipette tips	Rainin	17001118	Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
50 mL conical tube	VWR International	89039-656
96-Well ddPCR plate	Bio-Rad	12001925
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	Lonza	10-548E	Optional
Alcohol Wipes	Fisher Scientific	6818
Anesthesia Chamber	World Precision Instruments	EZ-178	Provided by animal facility
Anesthesia Machine	Parkland Scientific	PM1002	Provided by animal facility
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set	Becton Dickinson	367281
DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864007
DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O	Life Technologies	1811318
Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll	Fisher Scientific	45001750
Insulin Syringe	Fisher Scientific	329424
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	Provided by animal facility
Liquid nitrogen	N/A	N/A
Mouse Irradiator Pie Cage	Braintree Scientific, Inc.	MPC 1	Holds up to 11 mice
Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4")	Fisher Scientific	19-027-761
P1000 pipetman	MidSci	A-1000
P200 pipetman	MidSci	A-200
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040
Pipetaid Gilson Macroman	Fisher Scientific	F110756
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Rainin	17013805	Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69506
qPCR plates	VWR International	89218-292
QX200 Droplet Digital PCR System	Bio-Rad	12001925	Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications
QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen	Bio-Rad	1864006
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio-Rad	1864033
RNase and DNase-free plate seal	Thermo Scientific	12565491
RPMI Advanced 1640	Life Technologies	12633012
Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply)	Fisher Scientific	67522
Sterile Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	21040CV
Sterile reservoir	VWR International	89094-662
Surgial Scissors	Kent Scientific	INS600393-4
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650914-4