Induktion och poängsättning av graft-versus-host-sjukdom i en Xenogeneisk murin modell och kvantifiering av humana T-celler i mus vävnader med hjälp av digital PCR

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att inducera och värdering sjukdom i en xenogena graft-versus-host sjukdom (xenogvhd) modell. xenoGVHD ger en in vivo-modell för att studera immunsuppression av humana T-celler. Dessutom beskriver vi hur man detekterar humana T-celler i vävnader med digital PCR som ett verktyg för att kvantifiera immunsuppression.

Abstract

Akut transplantat-kontra-värd sjukdom (GVHD) är en signifikant begränsning för patienter som får hematopoietisk stamcellstransplantation som terapi för hematologiska brister och maligniteter. Akut GVHD uppstår när givare T-celler erkänna värd vävnader som ett främmande antigen och montera ett immunsvar till värden. Nuvarande behandlingar innebär giftiga immunsuppressiva läkemedel som gör patienter mottagliga för infektion och recidiv. Sålunda, det finns pågående forskning för att ge en akut GVHD terapi som effektivt kan rikta givare T-celler och minska biverkningar. Mycket av detta prekliniska arbete använder den xenogena GvHD (xenogvhd) murina modell som möjliggör testning av immunsuppressiva terapier på mänskliga celler snarare än murina celler i ett in vivo-system. Detta protokoll beskriver hur man inducerar xenoGVHD och hur man blinda och standardisera kliniska scoring för att säkerställa konsekventa resultat. Dessutom beskriver detta protokoll hur man använder digital PCR för att detektera humana T-celler i mus vävnader, som sedan kan användas för att kvantifiera effekten av testade terapier. Den xenoGVHD modellen ger inte bara en modell för att testa GVHD terapier men någon behandling som kan undertrycka mänskliga T-celler, som sedan kan tillämpas på många inflammatoriska sjukdomar.

Introduction

Allogen hematopoietisk stamcellstransplantation (HSCT) har blivit rutinmässig behandling för patienter som lider av hematologiska maligniteter såsom leukemi med dålig prognos. En signifikant komplikation av HSCT är akut transplantat-kontra-värd sjukdom (GVHD). En 2012 studie rapporterade att akut GVHD utvecklades i 39% av HSCT patienter som fick transplantationer från syskon givare och 59% av patienterna som fick transplantationer från icke-närstående givare¹. Akut GVHD uppstår när givare härledda T-celler angriper mottagarens organ. Den enda lyckade behandlingen för GVHD är behandling med mycket immunsuppressiva läkemedel², som är mycket giftiga och ökar risken för infektion och tumör upprepning. Således, trots förbättringar som har gjorts i akut GvHD överlevnad under de senaste åren^3,4,5, det finns fortfarande ett kritiskt behov av förbättrade GvHD terapier med minimal toxicitet som främjar långsiktig remission.

Det övergripande målet med följande metoder är att inducera och poängsätter xenogena GvHD (xenogvhd). Den xenoGVHD modell utvecklades som ett verktyg för att inducera akut GVHD med mänskliga celler snarare än murina celler möjliggör mer direkt översättning av preklinisk GVHD forskning till kliniska prövningar⁶. Denna modell innebär intravenöst injicering av Human perifert blod mononukleära celler (PBMC) i NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) möss som är sublethally bestrålade. Injicerade humana t-celler aktiveras av humana antigen presenterande celler (APCS) som presenterar murinantigen och de aktiverade T-cellerna migrerar till avlägsna vävnader som resulterar i systemisk inflammation och i slutändan död^{6,7, 8 , 9 , 10}. sjukdoms patologi och progression i xenogvhd-modellen imiterar nära Human akut GvHD. Specifikt, de patogena humana T-celler är reaktiva till murina större histocompatibility complex (MHC) proteiner, som liknar den T-cell alloreactivity i humant GvHD^6,9. Den främsta fördelen med xenoGVHD modellen över musen MHC-mismatch modell, den andra allmänt använda GVHD-modellen, är det gör det möjligt för testning av terapier på mänskliga celler snarare än murina celler. Detta gör det möjligt för testning av produkter som direkt kan översättas till kliniken utan några ändringar eftersom de är gjorda för att rikta mänskliga celler. Nyligen har denna modell använts för att testa en human anti-IL-2 antikropp¹¹, mänskliga thymic reglerande T-celler (Tregs)¹² och mänskliga mesenkymala stamceller¹³ som potentiella behandlingar för akut GvHD. I ett bredare sammanhang, denna modell kan användas som en in vivo dämpning analys för alla läkemedel eller celltyp som kan undertrycka mänsklig T cell aktivitet. Till exempel använde Stockis et al.¹⁴ xenoGVHD-modellen för att studera effekten av att blockera integrin αVβ8 på Treg suppressiv aktivitet in vivo. Således, den xenoGVHD modellen kan ge insikt i mekanismen för alla terapi inriktning T-celler i en in vivo inställning.

En ytterligare metod som beskrivs i detta protokoll är hur man upptäcker mänskliga T-celler i mus vävnader med hjälp av digital polymeras kedjereaktion (dpcr). Målet med denna metod är att erbjuda ett verktyg för att kvantifiera migration och spridning av T-celler i målvävnaderna, som mäter effekten av immunsuppressiva terapier som testas i denna modell. dPCR är en relativt ny metod för kvantifiering av nukleinsyror¹⁵. Kortfattat, PCR reaktionsblandningen är uppdelad i partitioner som innehåller små antal av målsekvensen eller inget mål alls. Målsekvensen förstärks sedan och detekteras med hjälp av DNA-interkalating färgämnen eller fluorescerande målspecifika sonder. dpcr kvantifierar antalet kopior av målsekvensen baserat på andelen positiva partitioner och Poissons statistik^15,16. Detektera T-celler med dPCR kräver mycket mindre vävnad jämfört med andra alternativa metoder, inklusive flödescytometri och histologi, och kan utföras på fryst eller fast vävnad. dPCR kräver inte en standardkurva för att bestämma kopierings nummer och inte heller är tekniska replikat krävs. Detta minskar mängden reagens och mallDNA som behövs för dPCR jämfört med traditionell kvantitativ PCR (qPCR)¹⁶. Partitionering av PCR-reaktionen i sub-reaktioner i dPCR koncentrerar effektivt mål¹⁷. Således är dPCR främst ett verktyg för detektering av sällsynta mål i en stor mängd icke-måldna. Till exempel, dPCR används för att upptäcka bakteriell kontaminering i mjölk¹⁸, identifiera sällsynta mutationer i östrogen receptor genen¹⁹, och upptäcka cirkulerande tumör-DNA i blodet hos patienter²⁰. I detta protokoll fungerar dPCR som ett effektivt verktyg för att detektera och kvantifiera humana T-celler i vävnader från möss med xenoGVHD.

Protocol

Alla mus experiment utfördes i överensstämmelse, och med godkännande från, University of Kansas Medical Center institutionella djuromsorg och användning kommittén. Alla friska humanblod prov erhölls under informerat samtycke och med godkännande från den institutionella Granskningsnämnden vid University of Kansas Medical Center. 1. bestrålning av NSG-möss En dag före PBMC injektion, bestråla 8 – 12-veckors gamla NSG möss (antingen kön kan användas). I ett sterilt b…

Representative Results

Sublethally bestrålade 8-12-veckors gamla NSG möss av båda könen som fick humant PBMC började Visa kliniska tecken på GVHD runt dag 10 efter injektion jämfört med negativa kontroll möss som fick PBS endast (figur 1a). XenoGVHD-möss hade en median överlevnad på 23,5 dagar (figur 1b). Med digital PCR kunde CD3 Epsilon positiva humana T-celler upptäckas i lungan och leverprover av möss som fick humant PBMC. Vävnadspro…

Discussion

Sjukdomsprogression är i allmänhet konsekvent i xenoGVHD-modellen, även med injektion av PBMC från olika givare, så att flera experiment kan kombineras. De viktigaste stegen som krävs för att bibehålla denna konsekvens är korrekt i.v. injektion teknik, bländande och konsekvent scoring. En studie av Nervi et al.²⁵ visade att jämfört med intravenös svans ven injektion, retroorbital injektioner av PBMC resulterade i mer konsekvent engrafktion och mer svår GvHD. Leon-Rico et al.<sup clas…

Materials

1.5 mL eppendorf tubes	Fisher	05-408-129
10 mL serological pipet	VWR International	89130-898
10mL BD Vacutainers – Green capped with Sodium Heparin	Becton Dickinson	366480
250 µL Ranin pipette tips	Rainin	17001118	Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
50 mL conical tube	VWR International	89039-656
96-Well ddPCR plate	Bio-Rad	12001925
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	Lonza	10-548E	Optional
Alcohol Wipes	Fisher Scientific	6818
Anesthesia Chamber	World Precision Instruments	EZ-178	Provided by animal facility
Anesthesia Machine	Parkland Scientific	PM1002	Provided by animal facility
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set	Becton Dickinson	367281
DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864007
DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O	Life Technologies	1811318
Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll	Fisher Scientific	45001750
Insulin Syringe	Fisher Scientific	329424
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	Provided by animal facility
Liquid nitrogen	N/A	N/A
Mouse Irradiator Pie Cage	Braintree Scientific, Inc.	MPC 1	Holds up to 11 mice
Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4")	Fisher Scientific	19-027-761
P1000 pipetman	MidSci	A-1000
P200 pipetman	MidSci	A-200
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040
Pipetaid Gilson Macroman	Fisher Scientific	F110756
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Rainin	17013805	Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69506
qPCR plates	VWR International	89218-292
QX200 Droplet Digital PCR System	Bio-Rad	12001925	Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications
QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen	Bio-Rad	1864006
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio-Rad	1864033
RNase and DNase-free plate seal	Thermo Scientific	12565491
RPMI Advanced 1640	Life Technologies	12633012
Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply)	Fisher Scientific	67522
Sterile Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	21040CV
Sterile reservoir	VWR International	89094-662
Surgial Scissors	Kent Scientific	INS600393-4
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650914-4