Agrobacterium tumefaciens og Agrobacterium rhizogenes-medieret Transformation af kartoffel og promotor aktivitet af en Suberin gen af GUS Staining
Summary
Vi præsenterer her, to protokoller for at omdanne kartoffelplanter. Agrobacterium tumefaciens transformation fører til et komplet transgene anlæg mens Agrobacterium rhizogenes producerer transgene behårede rødder i en vildtype skyde, der kan være selvstændige opformeret. Vi registrerer promotor aktivitet af GUS farvning i de transformerede rødder.
Abstract
Agrobacterium sp. er en af de mest anvendte metoder til at opnå transgene planter, som det har evnen til at overføre og integrere sine egne T-DNA i plantens genom. Vi præsenterer her, to transformation systemer til genetisk ændre kartoffelplanter (Solanum tuberosum). I A. tumefaciens transformation, bladene er inficeret, de transformerede celler er markeret og en ny komplet transformerede anlæg er regenereres ved hjælp af Phytohormoner i 18 uger. I A. rhizogenes transformation, stængler er smittet ved at indsprøjte bakterier med en nål, de nye opstået transformerede behårede rødder er opdaget ved hjælp af en rød fluorescerende markør og ikke-transformeret rødderne er fjernet. I 5-6 uger er den deraf følgende anlægget sammensat af en vildtype skyde med fuldt udviklede transformerede behårede rødder. For at øge biomassen, kan de transformerede behårede rødder skåret ud og selv opformeret. Vi anvendte begge Agrobacterium –medieret transformation metoder for at opnå rødder udtrykker GUS reporter gen drevet af en suberin biosyntetiske gen promotor. GUS farvnings-procedure er fastsat og tillader celle lokalisering af promotor induktion. I begge metoder viste de transformerede kartoffel rødder GUS farvning i korkagtige endodermis og exodermis, og derudover i A. rhizogenes omdannet rødder GUS aktivitet blev også fundet i fremkomsten af laterale rødder. Disse resultater tyder på, at A. rhizogenes kan være en hurtigt alternative redskab til at studere de gener, der udtrykkes i rødder.
Introduction
Bortset fra økonomiske interesse har generation af transgene planter sin egen relevans i forskning at vise den ultimative funktionen af gener og bedre forstå plantefysiologi og udvikling. Mest udbredte metode til plante DNA indsættelse er Agrobacterium-medieret transformation. Agrobacterium tumefaciens er i stand til at generere crown galls i det inficerede væv af mange plantearter ved hjælp af dens tumor-overtalelse (Ti) plasmid. Plasmidet indeholder en T-DNA region med et sæt af gener, der vil blive integreret i anlægget genom og fremkalde væv dedifferentiation1,2. Udvekslingen af disse gener inden for T-DNA af transgenet har tilladt generation af specifikke anlæg ændringer undgå fænotypisk virkninger3. For at lette transgenet kloning ind i T-DNA, T-DNA-regionen har været skåret ud i en uafhængig plasmid kaldet en binær plasmid, mens resten af gener for Ti-plasmidet (virulens gener, der giver mulighed for T-DNA overførsel og indsættelse mekanismer) har været placeret i en helper plasmid. For plante bioteknologi forskning, transformation af A. tumefaciens har flere fordele: det behøver ikke dyre enheder, er i stand til at generere både stabile og forbigående plante transformation og lavt antal gen kopier er integreret i den kromosom4. Men for de fleste planter, men ikke Arabidopsis, generation af stabile transformants kræver planten regenerering fra en enkelt eller et par celler ved hjælp af eksogene Phytohormoner, hvilket gør denne proces, besværlige og tidskrævende. A. rhizogenes er også i stand til Rediger genomet plante producerer behårede rødder eller utilsigtet rødder på infektion steder på grund af udtryk af rol (root loci) gener kodet i root-inducerende (Ri) plasmid5. Selv om mindre undersøgt end A. tumefaciens, bruges A. rhizogenes også til at opnå transgene rødder. I dette tilfælde indeholder A. rhizogenes den oprindelige T-DNA i Ri plasmid og en binær plasmid med en anden T-DNA transporterer transgenet. Når webstedet infektion er i stængler eller hypocotyls, kan en sammensat plante fås, med nye behårede transgene rødder opstår fra vildtype skyder. Alternativt, behårede transformerede rødder kan vokse autonomt in vitro- medier med carbon source indgange. Brugen af A. rhizogenes i stedet for A. tumefaciens at producere transgene væv vinder relevans når roden er målorgan, fordi anlægget regenerering er ikke nødvendig og derfor er det hurtigere og billigere. Tidligere undersøgelser har vist denne metode tilegnet til fænotypisk karakterisering af roden specifikke gener6,7,8,9.
Kartoffel (Solanum tuberosum) er den fjerde vigtigste afgrøde i verden Ifølge Levnedsmiddel- og Landbrugsorganisation af de Forenede Nationer (FAO), da knolden ernæringsmæssig relevans til konsum for at være en god kilde til vitaminer og mineraler. Derfor, kartoffel er blevet placeret i søgelyset for landbrugs bioteknologi og også betragtes som en god biologisk model for genetiske og udviklingsmæssige undersøgelser10,11. Kartoffel transformation bidraget væsentligt til forståelsen af molekylære mekanismer underliggende korkagtige væv gennem karakterisering af gener involveret i suberin og voks biosyntesen12,13,14 ,15,16,17, suberin monomer transport18 og transskription forordning19. Suberin feruloyl-transferase-genet, FHT, er en af disse karakteriseret biosyntetiske gener; dens downregulation giver anledning til en stærk forringelse af periderm beskyttelse, som er korreleret med en stærk nedgang i ferulate estere af suberin og voks i kartoffel knolde14. Samtidig, i rødder og frø af Arabidopsis demonstreret knockout af dens formodede orthologue (ASFT/RWP1) også sin rolle i at producere alkyl ferulates i suberin20,21. I kartoffel viste FHT transcriptional reporter linje og FHT antistof henholdsvis at promotor aktivitet og protein er placeret i exodermis, endodermis, phellogen-derivater og sårede væv15.
I dette arbejde detalje vi en protokol bruger A. rhizogenes til at producere transgene behårede rødder, der vedligeholdes i en vildtype skyde, generere sammensatte kartoffelplanter eller skåret ud til at vokse autonomt in vitro. Vi leverer også protokollen ved hjælp af A. tumefaciens for at opnå komplet transgene kartofler. Som case bruges A. rhizogenes og A. tumefaciens omdannet med den samme binære vektor til at få rødder med FHT promotor kørsel GUS reporter gen expression. Resultaterne indberettes og sammenlignet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I kartoffel bruger de mest almindelige system at opnå stabile komplet transgene planter omdannelsen af Agrobacterium tumefaciens stammer, der kræver organogenesis ved hjælp af eksogene Phytohormoner. Selv om protokollerne Agrobacterium baseret har potentiale til at integrere ikke-T-DNA vektor sekvens25, er denne metode stadig den letteste og mindre dyre tilgængelige at omdanne kartoffelplanter. I løbet af sidste år, interesse i A. rhizogenes-medieret transformation…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI tilskud til PB), Ministerio de Economía y Competitividad og FEDER finansiering (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) og universitetet i Girona (Ph.d.-stipendium til SF og tilskud SING11/1). Forfatterne er taknemmelig for, at Dr. Inge Broer (Institut for arealanvendelse, Universitet i Rostock, Rostock, Tyskland) og Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Spanien) for at give A. rhizogenes og A. tumefaciens stamme, henholdsvis, og Dr. Marçal Soler og Dr. Anna Plasencia for den hjælp og støtte modtaget i indledningen A. rhizogenes transformation eksperimenter (Toulouse III Paul Sabatier Universitet — CNRS, plante Research Laboratory (LRSV), Castanet-Tolosan Frankrig). Forfatterne takke Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) for hendes værdifulde bistand i udførelsen af laboratoriearbejde og pasning af planter, og Ferran Fontdecaba og Carla Sánchez der bistået med nogle af eksperimenterne, mens de gjorde deres endelige grad projekter.
Materials
|
Acetone |
Panreac |
1.310.071.21 |
|
|
Acetosyringone |
Acros |
115540050 |
|
|
Aquarium pump |
Prodac |
MP350 |
|
|
Autoclave |
Ragpa Strelimatic |
||
|
Bacteriological agar |
Lab Conda |
1800 |
|
|
BAP |
Duchefa |
B0904 |
|
|
Beef extract |
Lab Conda |
1700 |
|
|
Plant growing cabinet |
Nuaire |
||
|
Carbenicillin |
Duchefa |
C0109 |
|
|
Cefotaxime sodium |
Duchefa |
C0111 |
|
|
DMSO |
Merck |
1029310161 |
|
|
Ecotron infors |
HT |
29378 |
|
|
Ethanol |
Merck |
1,009,831,011 |
|
|
Falcon tube |
Control tecnica |
CFT011500 |
|
|
Ferricyanate |
Sigma |
101001081 |
|
|
Ferrocyanate |
Sigma |
100979088 |
|
|
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture |
Apiglass |
ref16 |
|
|
GA3 |
Sigma |
G7645 |
|
|
Gamborg B5 media |
Duchefa |
G0210 |
|
|
Gelrite |
Duchefa |
G1101 |
|
|
Glucosa |
Sigma |
G5767 |
|
|
Kanamycin |
Sigma |
K1377 |
|
|
Leukopor tape |
BSN Leukopor |
BDF47467 |
|
|
Lupe |
Wild-Heerbrugg |
M420 |
|
|
Magnetic shaker |
Agimatic |
7000243 |
|
|
MES hydrate |
Sigma |
M2933-25G |
|
|
MgSO4 |
Panreac |
131404 |
|
|
Microscope |
Olympus |
||
|
Minufugue centrifugue 5415R |
Eppendorf |
||
|
Murashige and Skoog media |
Duchefa |
M0254.0050 |
|
|
Na2HPO4 |
Panreac |
131679 |
|
|
NAA |
Duchefa |
N0903 |
|
|
NaCl |
Panreac |
131659 |
|
|
NaH2PO4 |
Sigma |
58282 |
|
|
NightSea Stereo |
SFA Moonting Adapter |
||
|
Parafilm |
Anorsa |
PRFL-001-001 |
|
|
Peptone |
Lab Conda |
1616 |
|
|
Petri dishes (90 x 14) |
Anorsa |
200200 |
|
|
pHmetre |
Crison |
||
|
Phytotron |
Inkoa |
RFTI-R5485 |
|
|
Plant Agar |
Duchefa |
P1001 |
|
|
Refrigeratot |
Liebherr Medline |
||
|
Rifampicin |
Duchefa |
R0146 |
|
|
Spectinomycin |
Sigma |
59007 |
|
|
Spectrophotometer |
Shimadzu |
||
|
Square plates (120 x 120) |
Deltalab |
200204 |
|
|
Streptomycin |
Sigma |
S6501 |
|
|
Sucrose |
Panreac |
131621 |
|
|
Surgical blades |
Swann-Morton |
201 |
|
|
Surgical needle |
NIPRO |
015/0204 |
|
|
Triptone |
Lab Conda |
1612 |
|
|
Triton |
Serva |
37240 |
|
|
Unimax 1010 shaker |
Heidolph |
||
|
Vacuum |
Dinko |
||
|
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous) |
Biosynth |
B-7398 |
|
|
Yeast extract |
Lab Conda |
1702.00 |
|
|
Zeatin riboside |
Sigma |
1001042850 |
Referências
- Gelvin, S. B. Traversing the Cell: Agrobacterium T-DNA’s journey to the host genome. Frontiers in Plant Science. 3, 1-11 (2012).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 467-481 (2013).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Ishida, Y., et al. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacteriumtumefaciens. Nature Biotechnology. 14 (6), 745-750 (1996).
- White, F. F., Taylor, B. H., Huffman, G. A., Gordon, M. P., Nester, E. W. Molecular and genetic analysis of the transferred DNA regions of the root-inducing plasmid of Agrobacterium rhizogenes. Journal of Bacteriology. 164 (1), 33-44 (1985).
- Dinh, P. T. Y., Brown, C. R., Elling, A. A. RNA Interference of effector gene Mc16D10L confers resistance against Meloidogyne chitwoodi in Arabidopsis and Potato. Phytopathology. 104 (10), 1098-1106 (2014).
- Horn, P., et al. Composite potato plants with transgenic roots on non-transgenic shoots: a model system for studying gene silencing in roots. Plant Cell Reports. 33 (12), 1977-1992 (2014).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2015).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacteriumrhizogenes as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
- Zhang, W., et al. Development and application of a universal and simplified multiplex RT-PCR assay to detect five potato viruses. Journal of General Plant Pathology. 83 (1), 33-45 (2017).
- Almasia, N. I., et al. Successful production of the potato antimicrobial peptide Snakin-1 in baculovirus-infected insect cells and development of specific antibodies. BMC Biotechnology. 17 (1), 1-11 (2017).
- Serra, O., et al. Silencing of StKCS6 in potato periderm leads to reduced chain lengths of suberin and wax compounds and increased peridermal transpiration. Journal of Experimental Botany. 60 (2), 697-707 (2009).
- Serra, O., et al. CYP86A33-Targeted gene silencing in potato tuber alters suberin composition, distorts suberin lamellae, and impairs the periderm’s water barrier function. Plant Physiology. 149 (2), 1050-1060 (2008).
- Serra, O., et al. A feruloyl transferase involved in the biosynthesis of suberin and suberin-associated wax is required for maturation and sealing properties of potato periderm. The Plant Journal. 62 (2), 277-290 (2010).
- Boher, P., Serra, O., Soler, M., Molinas, M., Figueras, M. The potato suberin feruloyl transferase FHT which accumulates in the phellogen is induced by wounding and regulated by abscisic and salicylic acids. Journal of Experimental Botany. 64 (11), 3225-3236 (2013).
- Serra, O., Chatterjee, S., Figueras, M., Molinas, M., Stark, R. E. Deconstructing a plant macromolecular assembly: chemical architecture, molecular flexibility, and mechanical performance of natural and engineered potato suberins. Biomacromolecules. 15 (3), 799-811 (2014).
- Vulavala, V. K. R., et al. Identification of genes related to skin development in potato. Plant Molecular Biology. 94 (4-5), 481-494 (2017).
- Landgraf, R., et al. The ABC transporter ABCG1 is required for suberin formation in potato tuber periderm. The Plant Cell. 26 (8), 3403-3415 (2014).
- Verdaguer, R., et al. Silencing of the potato StNAC103 gene enhances the accumulation of suberin polyester and associated wax in tuber skin. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5415-5427 (2016).
- Molina, I., Li-Beisson, Y., Beisson, F., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Identification of an Arabidopsis feruloyl-coenzyme A transferase required for suberin synthesis. Plant Physiology. 151 (3), 1317-1328 (2009).
- Gou, J. Y., Yu, X. -. H., Liu, C. J. A hydroxycinnamoyltransferase responsible for synthesizing suberin aromatics in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18855-18860 (2009).
- Banerjee, A. K., Prat, S., Hannapel, D. J. Efficient production of transgenic potato (S. tuberosum L. ssp. andigena) plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Science. 170 (4), 732-738 (2006).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. a. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
- Schmidt, J. F., Moore, M. D., Pelcher, L. E., Covello, P. S. High efficiency Agrobacteriumrhizogenes-mediated transformation of Saponariavaccaria L. (Caryophyllaceae) using fluorescence selection. Plant Cell Reports. 26 (9), 1547-1554 (2007).
- Petti, C., Wendt, T., Meade, C., Mullins, E. Evidence of genotype dependency within Agrobacteriumtumefaciens in relation to the integration of vector backbone sequence in transgenic Phytophthorainfestans-tolerant potato. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 301-306 (2009).
- Gaudin, V., Vrain, T., Jouanin, L. Bacterial genes modifying hormonal balances in plants. Plant Physiology and Biochemistry. 32 (1), 11-29 (1994).
- Nemoto, K., et al. Function of the aux and rol genes of the Ri plasmid in plant cell division in vitro. Plant Signaling &. Comportamento. 4 (12), 1145-1147 (2009).
- Visser, R. G. F., et al. Expression and inheritance of inserted markers in binary vector carrying Agrobacteriumrhizogenes-transformed potato (Solanumtuberosum L.). Theoretical and Applied Genetics. 78 (5), 705-714 (1989).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Pati, P. K., Rideau, M., Gantet, P. Hairy root research: recent scenario and exciting prospects. Current Opinion in Plant Biology. 9 (3), 341-346 (2006).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Ooms, G., Lenton, J. R. T-DNA genes to study plant development: precocious tuberisation and enhanced cytokinins in A. tumefaciens transformed potato. Plant Molecular Biology. 5 (4), 205-212 (1985).
- de Vries-Uijtewaal, E., et al. Fate of introduced genetic markers in transformed root clones and regenerated plants of monohaploid and diploid potato genotypes. TAG. Theoretical and applied genetics. 78 (2), 185-193 (1989).
- Bird, D., et al. Characterization of Arabidopsis ABCG11/WBC11, an ATP binding cassette (ABC) transporter that is required for cuticular lipid secretion. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 52 (3), 485-498 (2007).
- Luo, B., Xue, X. Y., Hu, W. L., Wang, L. J., Chen, X. Y. An ABC transporter gene of Arabidopsis thaliana, AtWBC11, is involved in cuticle development and prevention of organ fusion. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1780-1802 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DESPERADO/AtWBC11 transporter is required for cutin and wax secretion. Plant Physiology. 145 (4), 1345-1360 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DSO/ABCG11 transporter affects cutin metabolism in reproductive organs and suberin in roots. Molecular Plant. 3 (3), 563-575 (2010).
- Bjelica, A., et al. Fatty acid ω-hydroxylases from Solanum tuberosum. Plant Cell Reports. 35 (12), 2435-2448 (2016).
- Ding, Y., et al. Abscisic acid coordinates nod factor and cytokinin signaling during the regulation of nodulation in Medicago truncatula. The Plant Cell. 20 (10), 2681-2695 (2008).
- Isayenkov, S., Mrosk, C., Stenzel, I., Strack, D., Hause, B. Suppression of allene oxide cyclase in hairy roots of Medicagotruncatula reduces jasmonate levels and the degree of mycorrhization with glomus intraradices 1[w]. Plant Physiology. 139 (3), 1401-1410 (2005).
- Dalton, D. A., et al. Physiological roles of glutathione S-Transferases in soybean root Nodules 1[C][W][OA]. Plant Physiology. 150 (1), 521-530 (2009).
- Limpens, E., et al. RNA interference in Agrobacteriumrhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany. 55 (399), 983-992 (2004).
